ينتج بروتوكولنا عن جهاز دي سي دي نشط للغاية خال من النوى القابلة للكشف، والتي يمكن استخدامها في أي حل حيث الأكسجين مائي هو ملوث. التقنيات التي نستخدمها سهلة التكرار وضمان عدم وجود ملوثات نويات في المنتج. للبدء، والجمع بين ميكرولتر واحد من pVP91A-pcaHG التعبير PCD بلازميد و 20 ميكرولترات من E.coli BL21 المتاحة تجاريا في أنبوب.
نفض الغبار الأنبوب لخلط، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. لمواصلة تفاعل التحول، ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم على الجليد لمدة دقيقتين. إضافة 80 ميكرولترات من وسائل الإعلام SOC، ويهز في 225 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، صب خليط تفاعل التحول على أجار LB-أمبيسيلين، واستخدام موزع لوحة لنشر الخليط. غطي الطبق بغطاء، ويحضن اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. بعد ذلك، اختيار مستعمرة واحدة من لوحة، وتطعيم في 50 ميكرولترات من LB-ampicillin في قارورة Erlenmeyer 250 ملليلتر.
ضع القارورة على شاكر عند 225 دورة في الدقيقة لاحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. ثم, نقل 20 ملليلتر من الثقافة المحتضنة إلى قارورة سعة أربعة لتر مليئة لتر واحد من LB-ampicillin. هز في 225 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
كل ساعة، ارسم مليلتر واحد من الثقافة في cuvette لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر على مقياس ضوئي. كما يزيد كثافة الثقافة البصرية بالقرب من 0.5، وزيادة وتيرة القياسات إلى كل 15 دقيقة، حتى OD600 تصل إلى 0.5. ثم، نقل قارورة أربعة لتر إلى سلة من الجليد.
دوامة القارورة في حمام الجليد للحد من درجة حرارة الثقافة. نقل قارورة أربعة لتر إلى حاضنة في 17 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. استمر في مراقبة OD600 كل 20 دقيقة.
في 0.7 OD600، إضافة IPTG وكبريتات الحديد الأمونيوم الهيكساهيدات لإيجاد تركيز نهائي من 0.5 ملليمولار و 10 ملليغرام للتر الواحد، على التوالي. هز الثقافة عند 180 دورة في الدقيقة و 17 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. بعد الحضانة، ضع قارورة الثقافة في الجليد لمدة دقيقتين.
حصاد ملليلتر واحد من الخلايا المستحثة في أنبوب البولي بروبلين 1.5 ملليلتر microcentrifuge لتحليل SDS-PAGE. بعد ذلك ، صب الثقافة البكتيرية في زجاجات ، 500 ملليلتر كل زجاجة ، للطرد المركزي. بيليه الثقافة في أربع درجات مئوية و 3،000 مرات ز لمدة 20 دقيقة.
اِنّهُ المُتَرَكِر الماصات لإعادة تعليق الكريات، كل في 12.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة، والجمع بين كل اثنين من resuspensions في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بيليه الخلايا مرة أخرى كما سابقا.
ثم، والتخلص من عظمى، واستخدام ماصة لإضافة 10 ملليلتر من العازلة تحلل في كل أنبوب لإعادة تعليق الخلايا. بعد sonicating الأنابيب مع الخلايا المستحثة، صب البكتيريا في زجاجة البولي المبردة مسبقا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في 120، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية، وصب supernatant إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر الباردة.
بعد إعداد أداة FPLC مع عمود الراتنج المشحون بالنيكل ، قم بتحميل العينة إلى العمود بمعدل 0.15 ملليلتر في الدقيقة. غسل العمود مع 20 ملليلتر من العازلة النيكل في إيميدازول 20 ملليمولار. احتفظ بالغسل في أنبوب 50 ملليلتر للتحليل.
بعد ذلك، قم بغسل العمود بـ 15 ملليلتر من المخزن المؤقت للنيكل عند إيميدازول 125 ملليمولار. جمع elution في 19 كسور من 0.8 ملليلتر لكل من. غسل العمود مرة أخرى مع 15 ملليلتر من 100٪ النيكل العازلة B، وجمع 75 كسور إضافية من 0.2 ملليلتر لكل من.
مواصلة تحليل الكسور التي تم جمعها على 12٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE للتأكد من وجود PCD. أولا، إضافة 35 ميكرولترات من العازلة رد فعل إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 ملليلتر microcentrifuge. في الأنبوب ، والجمع بين خمسة ميكرولترات من كسور الكروماتوغرافيا الذروة و 500 نانوغرام من ثلاثة كيلو بيس زوج pxba فائقة التكويد.
ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد إعداد جل agarose وفقًا للمخطوطة، أضف 30 ميكرولترات من كل رد فعل إلى آبار في الجل. الكهرباء في 10 فولت لكل سنتيمتر في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة تقريبا.
الآن، وصلت صبغة G البرتقالية إلى نهاية الجل. على الفور، استخدم ماسح ضوئي للفلورسينت لتصوير إشارة بروميد الإتهيديوم للجل. مع وظيفة من كثافة وحجم بكسل الصورة، وتحديد حجم بكسل من أنواع الحمض النووي المختلفة، مثل الدوائر supercoiled، خطية، وseded.
لتحديد النسبة المئوية لكل نوع من أنواع الحمض النووي، قم بتقسيم حجم البكسل لأنواع الحمض النووي المفردة حسب الحجم الإجمالي للبكسل لجميع الأنواع الفردية. ويبين تحليل SDS-PAGE أن ذروة الاستئصال الثانية تحتوي على الحد الأدنى من التلوث بالبروتين، الذي يمثل هتيروديمر PCD النقي تقريباً والحد الأدنى من نشاط النوى غير القابل للكشف. وهكذا، الجمع بين هذه الكسور 10 من ELUTION PCD الثاني في أنبوب مخروطي خمسة ملليلتر لمزيد من التحليل.
بعد تنقية الكروماتوغرافيا الحجم استبعاد من PCD، في غرفة باردة درجة مئوية أربع، والجمع في أنبوب microcentrifuge حجم مناسب من كلوريد الصوديوم، هيدروكلوريد تريس، كلوريد المغنيسيوم، dithiothrel، PCA، وبلازميد pXba فائقة الكوتة لجعل مخزون 5X. ضع لوحة مسطحة القاع 96 بئرًا على الجليد ، ونقل 10 ميكرولترات من محلول 5X المجمع إلى الآبار. مباشرة قبل التحليل، إضافة إلى كل 10 ميكرولترات جيدا من كسور SEC PCD الفردية.
تعيين قارئ لوحة إلى درجة حرارة داخلية من 37 درجة مئوية، ونقل لوحة 96-جيدا إلى حامل لوحة. سحب حامل لوحة في الصك، وقياس الامتصاص في 290 نانومتر في فترات 20 ثانية لمدة ساعة واحدة. تعيين الصك لهز لوحة خمس ثوان قبل كل قراءة.
بعد ساعة واحدة، إضافة 10 ميكرولترات من حل وقف لكل بئر لإنهاء ردود الفعل. تنفيذ جل الكهرباء لكسور PCD SEC. حدد الكسور التي لها معظم نشاط أكسدة الأنيسول الخماسي الكلور، المشار إليها من خلال انخفاض الامتصاص وعدم وجود تلوث نويات ملاحظ.
قياس امتصاص في 280 نانومتر، وحساب تركيز ثنائي بزين ثنائي باندو الكلي على أساس امتصاص ومعامل الانقراض. تخزين الكسور المحددة للتخزين على المدى الطويل في ناقص 80 درجة مئوية. في هذه التجربة، وجد أن المؤتلف PCD، وهو heterodimer من الهيكساهيستيدين الموسومة PCAH وpcaG، وأعرب في الإشريكية القولونية.
تم تنقية الهتيروديمر لأول مرة عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب النيكل. يتم عرض امتصاص باللون الأزرق، ويظهر تركيز النسبة المئوية للنيكل العازلة B باللون الأحمر. التدفق من خلال يظهر البروتينات البكتيرية القابلة للذوبان التي لم ترتبط راتنج النيكل.
بعض PCD مُلَه في وجود إيميدازول 125 ميليمولار, ولكن غالبية البروتين يلتم في إيميدازول 250 ميليمولار. يشير تحليل SDS-PAGE التمثيلي إلى أن الكسور من خطوة التلوين كانت خالية من الملوثات. Gelروز هلام من المقايسة النوى يكشف التلوث من خلال مقارنة مع السيطرة السلبية دون إضافة بروتين والسيطرة الإيجابية الملوثة مع نوكلاز الحمض النووي.
كمية من مختلف أنواع الحمض النووي لوحظت في تحليل nuclease هلام agarose يظهر الكسور 29 من خلال 38 كان نشاط النوى قليلا، والتي تم اختيارها لتكون مجتمعة، وتركز، ومزيد من تنقية من قبل لجنة الأوراق المالية والبورصة البيانات من ثلاثة كسور لجنة الأوراق المالية والبورصة تمثيلية أظهرت أن تنقية PCD خفضت امتصاص في 290 نانومتر، مما يشير إلى أكسدة PCA. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام PCD المنقى وتحسينه في نظام الكسح الأكسجين المطلوب.
وهذا سيحدد المبلغ الدقيق من PCD اللازمة للنظام. وقد استخدمت هذه التقنية لإطالة عمر الفلوروفور في تجارب المجهر جزيء واحد، والتي سمحت لفترات أطول من جمع البيانات. وrifuge فائقة التركيز المستخدمة خطرة.
تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازنة بشكل صحيح قبل الدوران. بروميد الإتيهيدوم هو كاشف خطر. تجنب الاتصال بارتداء معدات الحماية الشخصية، والتخلص منها بشكل مناسب.
