وقد أيد هذا البحث من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى جائزة التطوير الوظيفي 1IK2BX001701، كتسا جائزة UL1TR000445 من المركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية، ومؤسسة العلوم الوطنية جائزة أرقام 1547757 و 1400969، والمعاهد الوطنية للصحة منح GM05551. محتوياته هي وحدها مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية أو المعاهد الوطنية للصحة.

1. التعبير عن S100A12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الخلايا المختصة BL21 DE3 مع البلازميد بجيمكس-S100a12 باستخدام معيار صدمة الحرارة بروتوكول 18 . إضافة 1 إلى 5 ميكرولتر من البلازميد إلى 50 ميكرولتر من البكتيريا في أنبوب ميكروسنتريفوج على الجليد. احتضان لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صدمة الحرارة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا على الجليد لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام سوك إلى الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة على شاكر المداري لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 150 ميكرولتر من رد فعل التحول على لب-أجار المتوسطة (تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين). احتضان لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مستعمرة واحدة. تطعيم 2 مل من لب (تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 4-6 ح عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري (300 دورة في الدقيقة). أود 600 يجب قراءة بين 1-3 وحدات الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من ثقافة بداية إلى 50 مل من زيم-5052 أوتويندووسائل الإعلام كتيون 26 تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. للحصول على أفضل التهوية والتعبير الأقصى، استخدم قارورة إرلنماير محشوة بحجم 250 مل. اهتز (300 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة، عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق البكتيرية إلى أنبوب الطرد المركزي. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (4000 x ج، 10 دقيقة) في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب وسائل الإعلام، تسجيل عينة، وتخزين لصق الخلية في -80 درجة مئوية. عينة مستقرة لسنوات. </li></ol> 2. تنقية S100A12 باستخدام الضغط المنخفض اللوني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند الخلايا في 30 مل من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن التعليق على الجليد إلى ليز الخلايا. استخدام ~ 20 واط الإخراج، 5 ثانية على و 5 ثانية دورة قبالة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل إلى أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة. توضيح الخلية المحللة بواسطة الطرد المركزي، 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف ونقل إلى 100 مل كوب البولي بروبلين نظيفة. تبريد الحل عن طريق وضع الكأس على الجليد. إضافة ضجةr وإضافة ببطء 11.20 غرام من كبريتات الأمونيوم. السماح للحل لإثارة على الجليد لمدة 1 ساعة إضافية. وهذا سيخلق حل 60٪ من كبريتات الأمونيوم ويعجل معظم البروتينات E. القولونية الذاتية. S100A12 ستبقى قابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الحل في 4 درجات مئوية، 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة إلى بيليه البروتين عجلت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف ونقل إلى أنابيب غسيل الكلى (موكو 3،500 كيلو دالتون). دياليز ضد 1 لتر من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 في 4 درجات مئوية. تغيير عازلة غسيل الكلى مرتين. اترك 4 ساعات بين التغييرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كروماتوجرافيا التبادل أنيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء اللوني على نظام الضغط المنخفض. معدل التدفق النموذجي هو 1 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موازنة 5 مل سيفاروس العمود مع 10 مل من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ~ 40 مل من حل S100A12 باستخدام مضخة عينة (جمع تدفق من خلال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود مع 10 مل من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير العمود مع التدرج 0-30٪ (بوفر B هو 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 M كلوريد الصوديوم) أكثر من 19 مجلدات العمود (كف، 95 مل). جمع 5 مل الكسور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ قسامة 10 ميكرولتر من كل جزء وتحليل باستخدام ميس سدز بادج مع تلطيخ كوماسي. تشغيل هلام باستخدام الجهد المستمر (20 V / سم) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع الكسور التي تحتوي على S100A12. S100A12 يعمل في ~ 10 كيلو دالتون بروتين على هلام تغيير طبيعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ركز الكسور إلى 5 مل باستخدام جهاز الترشيح الفائق (موكو 10 كيلو دالتون). أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 8 دقائق. تأخذ الجزء العلوي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبعاد حجم اللوني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتوازن عمود S75 مع 1 كف (120 مل) من 20 ملي تريس درجة الحموضة 8، 100 ملي كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن &lt;5 مل من كسور S100A12 المركزة (من الكروماتوغرافيا التبادل الأيوني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير العمود بمعدل تدفق 1 مل / م أكثر من 120 مل. جمع 5 مل الكسور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ قسامة 10 ميكرولتر من كل جزء وتحليل باستخدام سدز بادج مع تلطيخ كوماسي. التحقق من صحة هوية البروتين باستخداملطخة غربية أو مطياف الكتلة (كتلة جزيئية محسوبة من وحدة فرعية أحادية 10،575.0 دا، مقاسة 10575.4 دا). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسور بركة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس امتصاص البروتين A 280 باستخدام الطيف. استخدام المخزن المؤقت سيك كما فارغ. معامل الانقراض المحسوب ل هوموديمر S100A12 هو 5960 م -1 سم -1 . ملاحظة: الغلة النموذجية هي 35-45 ملغ من S100A12 لكل 50 مل من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة S100A12 إلى 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج (1 ملغ / أنبوب)، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 3. مضادات الميكروبات فحوصات النشاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متتالية H. بيلوري سلالة G27 على لوحات أجار الصويا أجار تستكمل مع 5٪ من الأغنام الدم (لوحات أجار الدم). تنمو 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية في الهواء الغرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم H. بيلوري في مرق البروسيلا تستكمل مع الكوليسترول 1X. ثقافة أكثر(250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية في الهواء غرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع H. بيلوري 1:10 إلى 50٪ مرق البروسيلا، 50٪ كالبروتكتين العازلة زائد 1X الكولسترول والثقافة في المتوسطة وحدها أو تستكمل مع 100 ميكرومتر كلوريد الزنك زائد 0، 100 أو 1000 ميكروغرام / مل من S100A12 المنقى. الثقافة تهتز بين عشية وضحاها (250 دورة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية في الهواء غرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، إجراء التخفيفات المسلسل ولوحة على لوحات أجار الدم. السماح للمستعمرات البكتيرية لتنمو لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية في الهواء غرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تعداد وحدات تشكيل مستعمرة لحساب نمو البكتيريا في وجود أو عدم وجود S100A12 و / أو الزنك الخارجية. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+and+S100A9:+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity,+traditional+risk+factors,+and+cardiovascular+disease.">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+(DAMP)+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).</li><li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves.">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li><li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines:+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells.">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li><li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins:+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes.">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li><li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling.">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li><li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+proteins+in+cancer.">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li><li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca2+/Zn2++signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine.">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li><li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+S100+proteins:+new+mechanisms+that+regulate+function.">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li><li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+immunity+beyond+iron:+a+role+for+manganese+and+zinc.">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li><li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Immunity:+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface.">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li><li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages.">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).</li><li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis.">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+structural+states+of+S100A12:+A+key+to+its+functional+diversity.">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence.">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+genotypes,+host+factors,+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease.">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li><li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma.">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li><li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastric+precancerous+cascade.">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li><li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer:+epidemiology+and+risk+factors.">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li><li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response.">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration.">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins.">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li><li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses.">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li><li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense,+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus.">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li><li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut.">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li><li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens.">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation.">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+calgranulin+proteins+S100A8,+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children.">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li><li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

ويرد بروتوكول كفاءة لكل من التعبير وتنقية S100A12 الإنسان. نظام التعبير E. القولونية هو الأداة الأكثر شيوعا المستخدمة لإنتاج البروتينات المؤتلف، وخصوصا عندما تكون هناك حاجة كميات ملغ للدراسات البيوكيميائية والبيوفيزيائية. وهناك تعزيز رئيسي للإجراء الموصوف هنا هو...

بروتينات S100 هي فئة من الأسرة EF- اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم مع مجموعة متنوعة من الوظائف 1 . يتم التعبير عنها بطريقة الأنسجة والخلية محددة، وتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية 2 ، 3 . فريدة من نوعها لبروتينات الكالسيوم ملزمة، بروتينات S100 المعرض على حد سواء وظائف داخل الخلية وخارج الخلية 4 ، 5 . داخل الخلية، كا 2 + ملزمة يؤدي إلى تغيير كونفورماتيونال الذي يعرض سطح مسعور الذي يستهدف على وجه التحديد البروتين شركاء ملزم 6 . هذه الآلية داخل الخلايا ينظم العمليات الهامة مثل تكاثر الخلايا، والتمايز والتمثيل الغذائي للطاقة. في الوسط خارج الخلية، بروتينات S100 تظهر وظيفتين 7 . في واحدة، أنها بمثابة الضرر المرتبطة الجزيئية نمط (دامب) البروتينات والشروع في المؤيدة للالتهاباتأتوري الاستجابة المناعية من خلال التفاعل مع مستقبلات التعرف على نمط 8 ، 9 . بالإضافة إلى ذلك، العديد من أعضاء فئة البروتين S100 عزل انتقال المعادن، وهي وظيفة التي تعمل على تجويع مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى الحصانة الغذائية 10 ، 11 . S100A12 (المعروف أيضا باسم كالغرانولين C و EN- ريج) وأعرب للغاية في الضامة والعدلات وتم التعرف على أنها العلامات البيولوجية المحتملة للأمراض الالتهابات 12 ، 13 . بالإضافة إلى الكالسيوم ملزمة في مواقع EF- اليد، S100A12 اثنين من تقارب عالية الانتقال المعادن مواقع ملزمة تقع على طرفي نقيض من واجهة ديمر 14 ، 15 . ويتكون كل موقع ملزم من ثلاثة مخلفات الحامض الاميني وبقايا حمض الأسبارتيك واحد ويمكن أن تشيلت الزنك أو النحاس &lt;سوب كلاس = &quot;كريف&quot;&gt; 16 ، 17 . في الآونة الأخيرة، أبلغنا أن المجاعة الزنك تعتمد على S100A12 مهم في تنظيم هيليكوباكتر بيلوري النمو ونشاط عوامل الفوعة المؤيدة للالتهابات 18 . H. بيلوري يصيب المعدة من حوالي نصف سكان العالم في العالم. مما يجعلها واحدة من أنجح الممرضات البكتيرية 19 . العدوى مع H. بيلوري يمكن أن يؤدي إلى نتائج مرض المعدة كبيرة بما في ذلك التهاب المعدة والقرحة الهضمية الاثني عشر، الغشاء المخاطي المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (مالت) سرطان الغدد الليمفاوية، وغدية المعدة الغازية (سرطان المعدة). سرطان المعدة هو السبب الرئيسي للوفيات غير المرتبطة بالسرطان غير القلب في العالم، وأكبر عامل خطر واحد المرتبطة بسرطان المعدة هو العدوى مع H. بيلوري . H. بيلوري يستمر في مكانة المعدة على الرغم من روبواستجابة المناعة المناعية للممرض، مما يؤكد الحاجة إلى فهم أفضل للآليات المناعية للسيطرة على هذه العدوى البكتيرية 20 ، 21 ، 22 ، 23 . يتميز بيلوري- التهاب مترافق مع تسلل عميق من الخلايا النوى متعددة النوى، أو العدلات، التي تودع ذخيرة من البروتينات المضادة للميكروبات، بما في ذلك S100A12، في موقع العدوى 18 ، 24 ، 25 . في محاولة لفهم الحوار المعقدة بين المضيف والممرض، سعينا إلى صقل تقنية لتنقية S100A12 واستخدامها لدراسة مضادات الميكروبات تؤثر عليه يمارس على هذا الممرض ذات الصلة طبيا. بروتوكول أدناه الخطوط العريضة تقنية محسنة لتنقية S100A12 في حالتها النشطة بيولوجيا. قادرة على ملزمة المعادن المغذية مع أفيني عاليةتي وخالب لهم بعيدا عن غزو الكائنات الحية الدقيقة. وعلاوة على ذلك، الأساليب أدناه تسليط الضوء على فائدة هذا البروتين كاشف حاسم لدراسة الآلية التي الجزيئات المضادة للميكروبات الفطرية تقيد نمو مسببات الأمراض البكتيرية. وقد اكتسبت البروتينات S100A الأسرة التقدير كمجموعة هامة من جزيئات نظام المناعة الفطرية التي تشارك في إشارة المناعة وكذلك الدفاع المضيف 27 . الأكثر دراستها جيدا هي كالبروتكتين (مرب-8/14، كالغرانولين A / B، S100A8 / A9) 28 ، 29 ، 30 . كالبروتكتين هو البروتين المرتبط العدلات التي تشكل هيتيروديمر من S100A8 و S100A9 الوحدات الفرعية التي تربط الانتقال المعادن في واجهة ديمر 31 . وقد تبين أن كالبروتكتين تمتلك اثنين من المواقع الملزمة المعدنية: الموقع 1 يمكن ربط زن 2+ ، من 2+ ، أو الحديد 2+ ، والموقع 2 يمكن<html> ربط زن 2+ 31 ، 32 . وقد أظهرت العديد من التقارير أن الكالبروتكتين لديها أنشطة مضادات الميكروبات ضد مسببات الأمراض المتنوعة بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية ، المبيضات البيض ، أسينتوباكتر بوماني ، كليبسيلا الرئوية ، الإشريكية القولونية ، والبكتيريا الحلزونية ، وأن الآثار المثبطة هي نتيجة لأنشطة خالب المعادن من كالبروتكتين 25 ، 28 ، 29 . العمل السابق أظهرت كالبروتكتين تمارس العديد من الأنشطة على H. بيلوري بما في ذلك تغيير الدهون في هيكل في الغشاء الخارجي، وقمع كاج-نوع الرابع إفراز النظام (وهو عامل فوعة بروينفلاماتوري كبير داخل H. بيلوري )، وتحفيز تشكيل بيوفيلم، وقمع H. بيلوري النمو والصلاحية بطريقة تعتمد على الجرعةكلاس = &quot;كريف&quot;&gt; 25 ، 33 . وعلاوة على ذلك، كشفت الفحوصات الجينية والكيمياء الحيوية النشاط المضاد للبكتيريا من الكالبروتكتين ضد H. بيلوري كان مستمدا إلى حد كبير من قدرته على ربط الزنك المغذيات 25 . يتطلب البوابية الزنك، كما تم تحديده من قبل البحوث السابقة التي تستخدم وسيلة محددة كيميائيا للتأكد من متطلبات المغذيات الدقيقة لهذا الممرض في النمو وتكاثر 34 . بالإضافة إلى ذلك، كان الكالبروتكتين وفيرة للغاية داخل الأنسجة الحلزونية الملوية البوابية ، ويرتبط مع تسلل العدلات، مشيرا إلى المضيف قد يكون توظيف الكالبروتكتين كاستراتيجية مضادات الميكروبات خلال العدوى والالتهاب اللاحق 25 ، 35 . تشير الأدلة الحديثة من تقنيات التحري البروتيني غير منحازة أنه في ظل ظروف حيث الأكسجين التفاعلية الأنواع وفيرة، كالبروتيكالقصدير يخضع التعديلات بعد متعدية التي تغير سداسي الهستيدين ملزم الموقع، وبالتالي تثبيط نشاط ملزم المعادن من البروتين 36 . على هذا النحو، افترضنا أن بروتينات أخرى S100A الأسرة بين ذخيرة واسعة من هذه الجزيئات يمكن أن تكون بمثابة المعادن المساعدة-تشيلاتورس. اخترنا S100A12 لمزيد من الدراسة لأنه لم يتم تحديدها في الشاشة المذكورة أعلاه لتعديل ما بعد متعدية، لديها القدرة على ربط الزنك، وأنها وفيرة للغاية في الأنسجة البشرية المستمدة من H. بيلوري- المصابين بالعدوى. عملنا يشير إلى أن S100A12 يمكن أن تمنع نمو البوابية وبقاء بطريقة تعتمد على الجرعة في سلالة G27 من H. بيلوري ، وأن النشاط المضاد للميكروبات من هذا البروتين يمكن عكسها عن طريق إضافة الزنك المغذيات الزائدة. هذا العمل يكمل عملنا السابق مشيرا إلى S100A12 النشاط المضاد للميكروبات ضد PMSS1 و 7.13 سلالات من الملوية البوابية ، مما يدل على نشاطها المضاد للبكتيريا واسعة ضد العديد من العزلات السريرية والسلالات المختبرية تكييفها من H. بيلوري 18 . معا، هذه النتائج تؤكد أهمية S100A12 كآلية للسيطرة على نمو البكتيريا وانتشارها عن طريق الحصانة الغذائية. الدراسات المستقبلية لهذا التفاعل المضيف البكتيرية الهامة يمكن أن تشمل استغلال نشاط S100A12 للحد من العبء البكتيرية داخل أنسجة المضيف، أو تحديد مساهمة هذا البروتين في الإشارات المناعية في سياق عدوى الملوية البوابية .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

بروتينات كالغرانولين هي وسطاء مهمين من الحصانة الفطرية وهي أعضاء في فئة S100 من الأسرة إف اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم. بعض البروتينات S100 لديها القدرة على ربط المعادن الانتقالية مع تقارب عالية وعزلها بشكل فعال بعيدا عن غزو مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى &quot;الحصانة الغذائية&quot;. S100A12 (إن-ريج) يربط كلا من الزنك والنحاس وفيرة للغاية في الخلايا المناعية الفطرية مثل الضامة والعدلات. نحن تقرير طريقة المكرر للتعبير، تخصيب وتنقية S100A12 في نشط، تكوين ملزم المعادن. استخدام هذا البروتين في نمو البكتيريا والتحليلات البقاء على قيد الحياة يكشف أن S100A12 له نشاط مضاد للميكروبات ضد الممرض البكتيرية ، هيليكوباكتر بيلوري . ويستند النشاط المضاد للميكروبات على النشاط ملزم الزنك من S100A12، الذي يخلط الزنك المغذي، وبالتالي تجويع H. بيلوري الذي يتطلب الزنك للنمو و proliferation.

S100A12 التعبير والتنقية وتنقية من ثلاث خطوات أنتجت ~ 40 ملغ من S100A12 المؤتلف من 50 مل من ثقافة البكتيرية. وكانت الخطوة الأولى هو هطول أمونيوم كبريتات من البروتينات E. القولونية الذاتية. وأعقب هذه ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12 at JoVE.com

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

هنا، نقدم طريقة للتعبير عن وتنقية S100A12 (كالغرانولين C). نحن تصف بروتوكول لقياس نشاطها المضادة للميكروبات ضد الممرض البشري H. بيلوري .

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Drugs for Peptic Ulcer Disease

SCIENTISTS IN ACTION

8.3K Views.  Fisk University.  هنا، نقدم طريقة للتعبير عن وتنقية S100A12 (كالغرانولين C). نحن تصف بروتوكول لقياس نشاطها المضادة للميكروبات ضد الممرض البشري H. بيلوري . 

Video: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...