المجهر ورقة ضوء شعرية هي تقنية التصوير قوية، ولكن مختبرات قليلة في العالم قادرة على استخدامه. هذا البروتوكول يعطي لمحة مفصلة عن كيفية استخدام المجهر ورقة ضوء شعرية المتاحة تجاريا. إنه نظام قوي للغاية قادر على التصوير رباعي الأبعاد للخلايا الفردية أو الأجنة التي تسمح بتتبع الجزيئات في الوقت الحقيقي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكن صورة ثلاثية الأبعاد خلايا حية واحدة أو أجهزة مع دقة ابصق واضاءة اضياء الصورة الحد الأدنى. نمط شعرية من ورقة الضوء يسمح لنا عينات صورة عالية السرعة والحصول على أشرطة الفيديو في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية ثلاثية الأبعاد والأعضاء مع التفاصيل الجزيئية التي التقنيات الأخرى لا يمكن تحقيق. هذا البروتوكول الفيديو الأول تبين كيف لنا شعرية ضوء ورقة المجهرية لصورة خلية واحدة أربعة الأبعاد.
هذا هو أسلوب معقد للغاية بسبب المحاذاة وإعداد العينة. ونحن نعتقد أن العرض المرئي سوف يحسن إمكانية الوصول من خلال السماح لمزيد من العلماء لتصوير العديد من الجزيئات والخلايا والأعضاء المختلفة في علم الأحياء. لبدء هذا الإجراء، احتضان خمسة ملليمتر يغطي جولة مع 0.1٪ بولي-L-ليسين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
التعرق قبالة السائل والسماح لأغطية الهواء الجافة بشكل طبيعي. بعد ذلك، إضافة ثلاثة ملليلتر من التدرج كثافة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. إضافة بعناية الخلايا قطرة الحكمة إلى حافة الأنبوب.
أجهزة الطرد المركزي في 930 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة الوسطى الرقيقة من الخلايا بين الوسائط الكاملة ومُكشف التدرج في الكثافة مع التأكد من وضع كل نوع خلية في أنبوب مخروطي منفصل. جهاز طرد مركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق لغسل الخلايا.
تجاهل افراط وإضافة خمسة ملليلتر من RPMI إلى أنابيب الخلايا التائية وخلايا CH27. كرر الغسيل مع RPMI الطازجة حتى يتم إجراء ثلاثة يغسل مجموع. ثم، resuspend الخلايا في كل أنبوب مع ملليلتر واحد من دورة في الدقيقة كاملة وعد الخلايا مع قياس الهيموسيت.
Resuspend مليون الخلايا المستضد في 500 microliters من دورة في الدقيقة كاملة وإضافة 10 MICROMOLAR MCC. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، resuspend مليون الخلايا التائية في 500 ميكرولترات من دورة في الدقيقة كاملة.
إضافة اثنين من ميكروغرام من المضادة TCR بيتا اليكسا 488 المسمى FAB واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، الطرد المركزي كلا الخلايا في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. إضافة 500 ميكرولترات من دورة في الدقيقة كاملة وكرر الطرد المركزي لغسل الخلايا.
كرر الغسيل مع RPMI الطازجة حتى تم تنفيذ ثلاثة يغسل مجموع التخلص من افرثال بعد كل غسل. بعد ذلك، إعادة إنشاء كلا النوعين الخلية في 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام التصوير. أولا، إضافة 10 ملليلتر من الماء و 30 ميكرولترات من الفلورسين إلى حمام LLSM.
اضغط على صورة الصفحة الرئيسية لنقل الكائن إلى موضع الصورة وننظر في نمط شعاع ليزر بسل واحد. محاذاة شعاع الليزر باستخدام دليل والمنطقة مسبقا من الفائدة لجعل شعاع نمط رقيقة متوازنة في جميع الاتجاهات. يجب أن تظهر الشعاع أيضا مركزة في الكاميرا مكتشف.
استخدام اثنين من ضبط الميل المرآة، والميمتر التركيز العلوي، واللون الهدف لضبط شعاع. بعد ذلك، قم بغسل الحمام والأهداف مع ما لا يقل عن 200 ملليلتر من الماء لإزالة أي فلوريسين تماما. لصورة حبات الفلورسنت القياسية، قم بتشغيل ثبات التردد عن طريق الإعداد إلى ثلاثة في مربع نطاق Xgalvo واضغط Live لعرض الحقل الحالي.
ضبط مرآة الإمالة، واللون الموضوعي، ومقياس التركيز يدوياً للحصول على أعلى القيم الرمادية. ثم، ضبط حسب الضرورة للحصول على أنماط مناسبة لمسح الهدف، Z galvo، Z زائد الهدف، ووضع العينة التقاط المسح الضوئي. بعد ذلك، اضغط على تنفيذ في وضع المسح الضوئي العينة لجمع وظيفة انتشار نقطة العينة ل de-skewing و de-convolution.
تغيير الليزر إلى وضع الألوان الثلاثة واضغط على تنفيذ مرة أخرى. للبدء، إضافة 100،000 الخلايا المضادة لتقديم إلى أغطية دائرية معدة قطرها خمسة ملليمتر والسماح لهم لتسوية لمدة 10 دقائق. الشحوم حامل العينة وإضافة غطاء إلى أنها الجانب الخلية لأعلى.
بعد ذلك، أضف قطرة من وسائط التصوير إلى الجزء الخلفي من الغطاء. المسمار حامل عينة على بيزو واضغط على الصفحة الرئيسية الصورة. العثور على خلية مستضد تقديم للصورة والتأكد من أن برنامج التصوير والي إم تعمل بشكل صحيح.
اضغط على Live لعرض الصورة الحالية. التحرك على طول Z للعثور على غطاء والخلايا. ابحث عن مركز خلية تقديم مستضد من خلال الانتقال في اتجاه Z، ثم اضغط على إيقاف لإيقاف الليزر.
تحقق من 3D وإدخال الإعدادات المطلوبة. مركز الصحافة ثم اضغط على تنفيذ لجمع البيانات. خفض المرحلة إلى موقف تحميل وإضافة 50 ميكرولترات من الخلايا التائية والتصوير وسائل الإعلام قطرة الحكمة مباشرة على غطاء.
فمن الأفضل للسماح نموذج قطرة على نهاية طرف ماصة ومن ثم لمس طرف إلى سائل الحمام. رفع المرحلة مرة أخرى عن طريق النقر على عودة الصورة. ابدأ التصوير.
تأكد من تعيين التكديس Z المطلوب وطول فترة المهلة. على سبيل المثال، الصورة 60 Z مكدسات في حجم خطوة ميكرومتر 0.4 و 500 إدخال الأطر الزمنية. توقف عن التسجيل قبل الوصول إلى 500 إطار لتجنب تبييض الصور.
استخدام الوضع المباشر للبحث عن أزواج الخلايا وعندما تم إدخال الإعدادات الجاهزة والمطلوبة، اضغط على تنفيذ لجمع البيانات. في هذه الدراسة، يتم عزل الماوس الأساسي 5CC7 الخلايا التائية وإعدادها ثم يتم تصويرها باستخدام مجهر ورقة الضوء شعرية. يظهر هنا مسار الحزمة الصحيح ومحاذاة الشعاع عند تصويرها بالفلورسين.
يجب أن يظهر الفحص الهدف شكل X كبير في إسقاط XZ و YZ متماثل قدر الإمكان. كما ينبغي تعديلها لتكون صغيرة من X قدر الإمكان. يجب أن يظهر مسح Z galvo بيضاويًا في XZ و XY مع نقطة واحدة على كلا الجانبين.
وأخيراً، يجب أن يظهر كل من المسح الضوئي الهدف Z بالإضافة إلى مسح العينة النقاط التي تبدو مستديرة قدر الإمكان. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن رؤية الديناميكيات رباعية الأبعاد لمستقبلات الخلايا التى على سطح الخلية التى. الميزة الرئيسية لهذا المجهر تكمن في القدرة على تتبع وحدات السطح المرئية لمستقبلات الخلية T والحصول على بيانات كمية من حجمها ، والحركة ، وكثافة الإشارة ، والإفرازات.
أهم شيء يجب أن نتذكره هو جودة محاذاتك. يجب أن تكون ورقة ضوء شعرية محاذاة يوميا وعدم القيام بذلك بشكل صحيح سيؤدي إلى التصوير المشوه. وبالمثل ، فإن نوعية PSF التي تم جمعها تؤثر بشكل مباشر على جودة de-convolution الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى جودة صورتك النهائية.
أحد الأسباب التي تجعل هذه الطريقة قوية للغاية لأنه يمكن استبدال كل خلية وتسمية لتصور العديد من أنواع الخلايا والجزيئات. لذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أي سؤال يتعلق بتتبع الجزيئات رباعية الأبعاد. ونعتقد أن هذه التقنية ستمهد الطريق أمام الباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة في مجال الاتجار الجزيئي.
لم يتم استخدامه على نطاق واسع بعد بسبب النظام المعقد لذلك نحن نأمل أن يؤدي هذا الفيديو جوف تحسين إمكانية الوصول إلى هذه التقنية. الليزر المستخدمة على النظام هي الفئة الرابعة لذلك يجب توخي الحذر المطلق لضمان سلامة الليزر. يرجى أخذ التدريب اللازم لسلامة الليزر قبل استخدام هذه الطريقة.
