وأيد MA كتبها زمالة شرودنغر للصندوق النمساوية العلوم (FWF، J3086-B11)، وذلك بفضل ماكس-بلانك جمعية الدعم المالي والإداري. ودعمت GS وJH من صندوق العلوم والتكنولوجيا فيينا (WWTF، LS13-030).

<ol>
	<li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple.">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition.">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li><li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers.">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158 (2015).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC.">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li><li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands.">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li><li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment.">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li><li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine.">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li><li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes.">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li><li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses.">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li><li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+repeat+proteins:+well-expressed,+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins.">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

قياس البروتين البروتين التفاعلات في الموقع المرغوب فيه جدا وخاصة عند التعامل مع التفاعلات تقارب منخفضة مثل TCR-PMHC ملزمة 11. وذلك لأن سعر الفائدة على وكذلك استقرار هذه التفاعلات تتأثر بشكل كبير بسبب الظروف الخاصة التي ملزم تأخذ مكان. النهج التصوير الحد الأدنى الغازية القائم على الحنق وبالتالي من حيث المبدأ مناسبة تماما لمثل هذه المهام، ولكن تنطوي على عدد من العقبات التي لا بد أولا من التغلب عليها. الضوضاء الناتجة عن تألق ذاتي الخلوية يحد من حساسية القياسات وبالتالي يجب أن تبقى في الحد الأدنى. يخدم TIRF المجهري هذه الحاجة بشكل جيد جدا 12 ولكن يتطلب functionalization الزجاج الشرائح، من الناحية المثالية في شكل مستو المدعومة من الزجاج الدهون طبقة ثنائية مزينة البروتينات من اختيار 13-15. ميزة أخرى لنهج reconstitutive جزئيا هو أن المؤتلف شركاء الحنق-طبقة ثنائية المقيمة يمكن أن يكون أكثر من مترركاز المسمى بسهولة في، الموقع محددة بطريقة كمية وعقلانية مع fluorophores أصغر حجما وأكثر إشراقا مما هو ممكن مع خلية البروتينات أعرب السطح. يتم تمييزها TCRs مع المؤتلف SCF V، والتي لا تؤثر الاعتراف T-الخلية، كما تم اختباره سابقا 2. وعلاوة على ذلك، وتكوين البروتين من SLB، على سبيل المثال كثافة pMHCs واختيار عوامل التبعية يمكن تعديلها لاحتياجات الفرد المحددة. لقد قمنا في السابق تجارب مع كثافة pMHCs المحفزة متفاوتة، ولكن لم يتم الكشف عن اختلافات كبيرة في 2D-K قبالة و2D-K D 2. حتى الآن هنا تم التعامل الاعتراف MHC الدرجة الثانية الجزيئات فقط، وذلك أساسا بسبب طبيعة المشقوق من الببتيد ملزم، وهو مفتوح في كلا طرفي وبالتالي يستوعب الببتيدات أكبر بما في ذلك رابط لمرفق fluorophore. في بعض الحالات يمكن أن يعمل هذا النهج أيضا لوضع العلامات MHC CLASS I الجزيئات 16 ولكن ينبغي أن تؤخذ بحذر شديد للتحقق من استخدامها في التجارب. لا ينبغي أن يؤثر على حساسية الخلايا التائية نحو مستضدات، والتي يمكن قياسها عن طريق فحوصات انتشار خلايا T، فضلا عن PMHC-TCR حركية ملزمة كما تم قياسها في المختبر عن طريق مأكل سطح الرنين من خلال إضافة رابط وfluorophore ل الببتيد. بدلا من ذلك، والطبقة MHC I الجزيئات نفسها يمكن أن توصف بطريقة خاصة بالموقع مع إدخال السيستين المفردة ضمن تسلسل السلسلة الثقيلة (الملاحظات غير منشورة). مع استخدام المجسات الجزيئية المناسبة أي متشابك تفاعل البروتين البروتين يمكن من حيث المبدأ أن تدرس بطريقة الموصوفة هنا. مثل هذه التحقيقات، على سبيل المثال، يجب أن يكون SCF V الصورة أو تصميم Ankyrin كرر البروتينات (DARPins) 17، الأحادي، وينبغي ربط هدفهم مستقر دون التأثير على التفاعل في المصالح. وبطبيعة الحال، و المعلومات الهيكليةn غير مرغوب فيه للغاية لتصميم التحقيق العقلاني ولكن لا حاجة على الاطلاق. عند وضع زوج جديد من الشركاء الحنق، فمن المستحسن لتسجيل وتحليل الحنق بكميات كبيرة لأول مرة. مواقع الحجز التسمية قد تختلف إلى حد كبير لتعظيم إشارة الحنق وأيضا للتحقق من أن تقاس الحنق عوائد تختلف بناء على المسافة بين الصبغة. مرة واحدة هو الأمثل النظام، جزيء واحد الحنق قد يتم تسجيل الإشارات عن طريق الحد من وسم الشريك الحنق وفرة عالية ل10-30٪ وتبيض الشريك الحنق وفرة منخفضة حتى الجزيئات المفردة للحل في مجال الإضاءة. أخيرا وتجدر الإشارة ليس أقلها أن SLBs تقريب بعض وليس كل جوانب غشاء البلازما الفسيولوجية. الصفات مثل انحناء الغشاء والمرونة، وتجزئة المجال إعادة ترتيب هيكل الخلية والحركة المحمولة، فضلا عن مجموعة متنوعة عالية من البروتينات وأعرب سطح الغشاء لا يمثله SLBs ولكن قد تؤثر رانه عملية قيد التحقيق. ستحتاج بذل الكثير من الجهد لاستثمارها لإقامة طرائق التصوير التي تسمح برصد تفاعلات البروتين البروتين لقرار جزيء واحد في نقاط الاشتباك العصبي الفسيولوجية، والتي لا يمكن الوصول إليها لتصوير TIRF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

تسجيل الكالسيوم داخل الخلايا عن طريق الصبغة الكالسيوم FURA-2، وكذلك التحليل الخلوي لاحق للتحقق من فعالية تنشيطية وبالتالي ظائف في الشكل 4 SLBs. كما يصبح واضحا، وارتفاع مستويات الكالسيوم في الخلايا التائية (معبرا عنها تطبيع FURA-2 340nm / 380nm نسبة مع خط الأساس يجري 1) على الفور بمجرد أن يستقر على SLBs المحفزة. مستويات الكالسيوم العودة إلى مستويات خط الأساس بعد فترة وجيزة من إضافة الأجسام المضادة التي تمنع pMHCs من المشاركة TCR والتي تنتهي تي خلية التنشيط. الرقم 6 يصور تجربة نموذجية تشمل الحنق الانتعاش المانحة بعد التبييض متقبل، التي تستخدم لقياس إنتاجية الحنق والذي يعمل لحساب القيم 2D-K D (كما هو موضح في الشكل 4). من فضلك لاحظ زيادة في كثافة الحنق المانحة، التي تمثل TCR المسمى عبر AF555، بعد الاستئصال السريع والكامل من الحنق علىالأنواع cceptor (هنا: AF647 المرتبطة pMHCs). كما واضح هو انخفاض شديد في القناة الحنق، أي قناة الحنق متقبل تحت الحنق الإثارة المانحة، بعد الحنق متقبل التبييض. إشارة بالكاد مرئية المتبقية يتوافق مع الحنق bleedthrough المانحة. عائدات الحنق داخل microclusters TCR الفردية أو نقاط الاشتباك العصبي كلها تحسب على أساس أشار قيم الكثافة قياس (الشكل 6B). الرقم 7 يصور مسار والفاصل الزمني من جزيء الحنق حدث واحد وضوحا في إطارين زمنيين. كما هو موضح أعلاه في مقدمة يحدث مثل هذا السلوك من قبل كل من اضمحلال متشابك TCR-PMHC ملزمة وphotobleaching من. للتمييز بين هذه المساهمات، وهما الأطر الزمنية اكتساب التجريبية يجب أن تكون متنوعة من حيث المدة: بينما لا يزال photobleaching من ثابت، وحدوث تغيرات في الحنق طول مسار الحدث إلا من خلال حركية ملزمة. A الكميات من tracelengths، ث<html> هيك يشكل أساسا لحساب خارج الأسعار وتبيض هو مبين في الشكل 7، ترد في الجداول 1-3. يتطلب تحديد 2D-K D ق تسجيل معظم الحنق العوائد لTCRs المسمى الحنق الجهات المانحة. مع استخدام C ثابت استنتاجها تجريبيا (الشكل 4)، وهو عائد الحنق قياس لmicrocluster TCR أو المشبك بأكمله يمكن تحويلها إلى TCR الإشغال لذلك، أي نسبة TCRs PMHC تشارك ومجموع (الشكل 4C) . ذات الكثافة PMHC المعروفة موجودة على SLB قبل إضافة خلايا T، ويمكن تطبيقها على القيم لتحديد القيم 2D-K D متشابك (الشكل 4D). ويمكن حساب أسعار الفائدة على مع قانون العمل الجماهيري (2D-ك على = 2D-K قبالة / 2D-K D) من متشابك تحديدها خارج معدل والقيم 2D-KD. 1 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. مخطط تخطيطي للدهن طبقة ثنائية (SLB) النظام المدعومة من الزجاج مستو. وتتكون (A) SLBs من POPC (90-99٪) والدهون الاصطناعية DGS ني NTA (1-10٪) وتشكل تلقائيا عندما يتم تحميل أسطح زجاجية نظيفة مع حويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي)، ويتألف من الدهون المقابلة. (B) وبمجرد تشكيل مثل SLBs يمكن functionalized مع أجزاء قابلة للذوبان الموسومة polyhistidine خارج الخلية المستمدة من pMHCs، costimulatory B7-1 البروتينات وICAM-1 البروتينات التصاق، لتكون بمثابة ناقلات الجنود المدرعة لخلايا تي. لمزيد من المعلومات حول إعداد SLBs الرجوع إلى Axmann وآخرون (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> فيقو<html> 2. إعادة فورستر الرنين الطاقة القائمة على نقل فحص ل quantitate TCR-PMHC ملزمة في الموقع. (A) يوضح هيكل مركب من TCR المعقد مع H57 سلسلة واحدة جزء إشراك PMHC النهج القائم على الحنق الموصوفة هنا. لاحظ مسافة قصيرة من حوالي 41A فصل اثنين من fluorophores المقابلة تمر الحنق. يشار إلى مواقع متقبل لfluorophore-maleimides باللون الأخضر والأحمر. (B) ويوضح مبدأ الكشف عن التفاعلات TCR-PMHC في الموقع. فقط -decorated SCF V TCRs وpMHCs (هنا IE ك)، والتي تشكل مجمعات محددة، تؤدي إلى إشارة الحنق قابلة للقياس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> &quot;/&gt; الشكل 3. الاستشرابية من النهائي خطوة الترشيح هلام مما أدى إلى أحادى SCF V الصورة وتحميل الببتيد IE ك -2x6H الجزيئات. وتمثل X-محاور حجم الاحتفاظ في مل، Y-محاور تشير الامتصاصية في 280 نانومتر في وحدات التعسفي (AU) . (A) الموقع تحديدا المسمى H57 SCF V مع تعرض اليكسا فلور 555 maleimide لS75 اللوني لفصل الصبغة المتفاعل من البروتين (الخطوة 1.2.5). الكسور المقابلة لفترة احتفاظ 14 to15 مل (الخطوط المتقطعة) تمثل صفت أحادى H57 SCF V. (B) IE ك جزيئات -2x6H المعقد مع الأشعة فوق البنفسجية شطورة ANP الفضاء حامل الببتيد كان المشع أشعة فوق البنفسجية، حضنت مع اليكس الموقع على وجه التحديد 647 المسمى maleimide الببتيد وتعرض أخيرا لS200 اللوني لفصل البروتين من الببتيد المجاني (خطوة 1.1.2.4). الفترة الزمنية الفاصلة بين الخطوط المتقطعة يحتوي على مطوية بشكل صحيح وpMHCs مركب بسيط. (A، B) </sترونج&gt; تم تطبيق 0.7 مل عينة إلى عمود في بداية الروم (0 مل نقطة). وتركزت الكسور التي تم جمعها. تم تحديد نسبة البروتين إلى صبغ التي كتبها photospectrometry قبل غسيل الكلى ضد PBS / 50٪ الجلسرين (للتخزين في -20 درجة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> الشكل 4. تحديد 2D-K D الصورة و2D-ك على الصورة. (A) والعلاقة بين العائد الحنق على النحو الذي يحدده الانتعاش المانحة بعد تم قياس تبييض متقبل والإشغال TCR تجريبيا. يمكن تحديد الإشغال TCR للفرد microclusters TCR كما هو موضح في القسم 4.2. يتم عرض تناسب خطية من البيانات عن طريق الخط، المنحدر من الذي يساوي نسبة C بين TCRالإشغال والعائد الحنق. C غير محددة المستمر لنظام الحنق وfluorophores (هنا CY3 وCy5) المستخدمة. في هذا المثال انها اسفرت عن 1.988. (B) الحنق تم تحديد البيانات العائد لmicroclusters TCR الفردية (N = 187، درجة الحرارة = 24 درجة مئوية) من خلال استرداد المانحين متقبل التبييض. الأرقام أدناه الحانات الرسم البياني تشير إلى الحد الأعلى خلال الفترة (C) تحويل البيانات الواردة في (ب) عن طريق ضرب قياس تأكل الغلة مع ثابت C تحديدها في (A). الأرقام أدناه الحانات تشير إلى الحد الأعلى خلال الفترة (D) الرسم البياني (شبه لوغاريتمي، قاعدة = 4) التي تصور توزيع 2D-K D ق قياس للفرد microclusters TCR. يشار إلى متوسط ​​2D-K D باللون الأزرق. الأرقام أدناه الحانات تشير إلى الحد الأعلى خلال الفترة. (E) والرسم البياني هو مبين في (D) تم تحويلها الباحثالزراعة العضوية 2D-ك على -histogram (شبه لوغاريتمي، قاعدة = 4) توظيف ك متشابك خارج لمدة 24 ° C (0.41 ث -1). يشار إلى تحديد متوسط ​​2D-ك على قيمة باللون الأزرق. ونشرت بيانات أصلا في Huppa وآخرون. 2 وتصور هنا في شكل جديد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> 5. التحقق من صحة الرقم الوظيفي للSLBs يعمل لتحفيز خلايا T والتصوير. واجهت (A) TCR المعدلة وراثيا الانفجارات T-الخلية محملة FURA-2 مع تنشيطية SLB إيواء pMHCs المستضدية، ICAM-1 و B-7. سجلت الخلوي FURA-2 الانبعاثات متحمس في 340 نانومتر و 380 نانومتر، وكذلك الصور DIC. كما هو مبين، والقيم نسبة كثافة الانبعاثات متحمس في 34وترد 0 و 380 نانومتر في اللوحة اليمنى. يتميز أدت إضافة PMHC منع الأجسام المضادة 14 دقيقة في المدى التجريبي إلى انخفاض في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا مماثلة لتلك التي يستريح خلايا T. (B) لمحة الزمني نموذجية من متوسط ​​نسب FURA-2 في الخلايا التائية الاتصال SLBs المحفزة قبل ارتفاعا الأولي في الكالسيوم داخل الخلايا وهو أعلى 2-4 مرات مقارنة بما كان عليه من غير تنشيط خلايا تي T-أو خلايا المحرومين من المستضد بعد الحصار بوساطة الأضداد. الدوائر الخضراء تشير إلى نقاط الوقت هو موضح في (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> الرقم 6. السائبة تأكل الغلة التي تقاس من خلال الحنق الانتعاش المانحة بعد الحنق متقبل التبييض. <strأونج&gt; (A) يظهر هو مثال نموذجي متشابك الحنق-القياس. كما هو موضح على اليسار وعلى رأسها واكتسب سلسلة من الصور مع استخدام الخائن شعاع الانبعاثات مما أدى إلى المانحة الحنق وقناة الحنق متقبل (للحصول على معلومات أكثر تفصيلا عن شق شعاع الرجوع إلى Axmann آخرون 4). الخط الذي يظهر في الصورة DIC اليسار يشير إلى حدود المشبك T-الخلية. ملاحظة خسارة في كثافة داخل القناة متقبل الحنق هو كذلك الزيادة في كثافة في القناة المانحة الحنق بعد الحنق متقبل تبيض (الخطوة 4). (B) الحنق ويمكن قياس الكفاءة كما هو مبين في مناطق متشابك الفردية أو نقاط الاشتباك العصبي بأكمله. للتفتيش، وتظهر الصور قبل وبعد الحنق متقبل تبييض مع استخدام اثنين من جداول البحث (طرفيات المستعملين المحليين والأخضر والفيزياء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> </p&gt; <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> الرقم 7. جزيء واحد الحنق تظهر الأحداث وتختفي الخطوات insingle والمنحازة تماما مع واحد fluorophore متقبل الحنق ويظهر هذا الفاصل الزمني من جزيء واحد الحنق الحدث. تم الحصول على الصور باستخدام كاميرا EMCCD الخلفية مضاءة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> الرقم 8. تحديد τ قبالة = 1 / K الخروج من مسارات smFRET قياسها. (A) المبالغ المتراكمة تطبيع إشارات الحنق يمكن ملاحظتها (مشتقة من H57 SCF V -AF555 زينت 5c.c7 TCR الانفجارات المعدلة وراثيا T-خلية تعترف IE &lt;سوب&gt; ك / K3-AF647 في 24 ° C) لأربع التخلف زمنية مختلفة (42 ميللي ثانية، 490 ميللي ثانية، 1007 ميللي ثانية، 1989 ميللي ثانية) تم التخطيط بوصفها وظيفة من إجمالي عدد الملاحظات. وظائف تناسب أحادية الأسي تثير المقابلة معكوس السلبي للقيم التوقع &lt;ن (ر متخلفة)&gt;. تم التخطيط (B) القيم التوقع ضد التأخير ر تأخر ومزودة باستخدام معادلة &lt;ن (ر متخلفة)&gt; = τ قبالة / {(τ قبالة / &lt;ن تبييض&gt;) + ر تأخر} لانتاج τ قبالة و&lt;ن تبييض&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay at JoVE.com

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

قياس TCR-PMHC التجليد<em&gt; في الموقع</em&gt; باستخدام الميكروسكوب الفحص القائم على الحنق

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.2K Views.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

Video: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

قياس الكمي في الموقع التدفقات باستخدام جهاز قائم بذاته Velocimetry تحت الماء (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

التحديد الكمي للكائنات الحية الدقيقة في تركيزات منخفضة باستخدام المجهر المجسم الرقمي (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

في الموقع المجهر لتحديد في الوقت الحقيقي من المورفولوجية خليه واحده في العمليات الحيوية

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

تعريف عالي الإنتاجية للمقاومة لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم في الطماطم باستخدام الشتلات الفيضانات أساي

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

القياس المستمر للضوضاء البيولوجية في الإشريكية القولونية باستخدام المجهر الفاصل الزمني

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...