واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية لتميز الناقلين غشاء هو أنه يمكنك تحديد التقارب النسبي للنقل لركائز محددة، فضلا عن الحصول على نظرة ثاقبة على آلية النقل. توصيف البروتينات الأغشية التي تستخدم تدرجات البروتين لدفع النقل الركيزة مناسبة بشكل خاص لهذا من الداخل إلى الخارج فحص الحضيض التي نثبتها هنا. في حين أن هذا الفحص يتطلب بعض المعدات المتخصصة مثل الصحافة الفرنسية والوصول إلى الطرد فائقة التركيز ، نعتقد أنه قد يكون أسهل من الناحية الفنية من المقايسات التي تتطلب ناقلات الأغشية لإعادة تشكيلها في liposomes الاصطناعية.
والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكننا من تحديد النسب النسبية للركائز المختلفة والقيام باختبارات المنافسة لاختبار تأثير الركائز المتنافسة على قضبان النقل. في حالة الناقل BAT1 المستخدمة لتوضيح هذا الفحص، كنا أيضا قادرة على إظهار التنشيط الركيزة من الناقل من قبل أرجينين. لبدء هذا الإجراء، والثقافة أعدت E.coli الخلايا المتحولة التي تعبر عن البروتين المستهدف عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام بوليامين 3 مع المضادات الحيوية المناسبة وتنميتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، نقل هذه الثقافة إلى 500 ملليلتر من وسائل البوليمين الطازجة 3 وسائل الإعلام التي تستكمل مع 0.0002٪ arabinose وتنمو حتى ثقافة الخلية تصل إلى OD600 بين 0.6 و 0.8. بعد ذلك، الطرد المركزي في 2000 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لجمع بيليه الخلية. إعادة تعليق بيليه وغسلها ثلاث مرات مع العازلة واحدة عن طريق الطرد المركزي في 2000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في كل مرة.
يجب أن يكون حجم النهائي من الخلايا في المخزن المؤقت واحد بعد الدوران الثالث 10 ملليلتر. حدد خلية ضغط فرنسية 35 ملليلتر وصب تعليق الخلية في جسم الخلية. قم بتشغيل الجهاز باستخدام المفتاح على RHS في الجزء الخلفي من الوحدة، وقم بتعيين مفتاح تحديد النسبة إلى مرتفع.
تشغيل مفتاح المضخة. سيبدأ المكبس في الارتفاع من القاعدة لإزاحة الهواء في الغرفة. زيادة الضغط عن طريق تحويل صمام زيادة الضغط في اتجاه عقارب الساعة حتى يصل مقياس 640 PSI.
وهذا سيخلق ضغطا داخليا قدره 000 10 من PSI. بمجرد أن تصل الخلية إلى ضغط الهدف، افتح تجميع صمام التدفق قليلاً عن طريق تحويلها عكس اتجاه عقارب الساعة. ضبط فتحة صمام للسماح لمعدل تدفق فقط حوالي 10 قطرات في الدقيقة الواحدة.
عندما خط التوقف على الجسم المكبس تصل إلى أعلى الخلية تدفق التبديل قبالة مضخة. خفض لوحة أسفل عن طريق وضع التبديل محدد نسبة إلى أسفل، ومن ثم، تعيين مفتاح المضخة على. عندما يتم سحب لوحة أسفل تماما، والحد من ضغط النظام إلى الصفر عن طريق تحويل صمام زيادة الضغط تماما عكس عقارب الساعة.
قم بإيقاف تشغيل مفتاح المضخة وإيقاف تشغيل الجهاز. جهاز طرد مركزي الصحافة الفرنسية eluant في 10،000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الخلايا غير المنقطعة ومخلفات الخلية. تجاهل بيليه ونقل سوبرنانت إلى أنابيب فائقة التركيز.
فائقة الrifuge المنابع في 150، 000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ل بيليه حويصلات الغشاء. غسل الغشاء الصدّيات مرة واحدة دون إعادة التعليق في العازلة الثانية. ثم، استخدام طاحونة الأنسجة Dounce لإعادة تعليق الغشاء في عازلة اثنين.
إعداد 100 ميكرولتر aliquots من الاستعدادات الغشاء في 1.5 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي وتخزينها في ناقص -80 مئوية. أولاً، غسل وإعادة تعليق الفحوى في 30 ملليمولار من تريس في 7.8 pH، الذي يحتوي على 0.1 ملليمتر من كلوريد الكوبالت الثاني. إضافة ميكرولتر واحد من carboxypeptidase A في كلوريد الصوديوم، تريس، والكوبالت الثاني كلوريد لكل عينة ميكرولتر 100.
احتضان في 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إضافة خمسة ميكرولترات من محلول يحتوي على EDTA الصوديوم و 2-Mercaptoethanol في PH 7.5 لوقف الهضم. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لإبزيم تماما.
بعد ذلك، أضف ما بين خمسة و10 ميكرولترات من محلول يحتوي على كبريتات ليثيوم دوديسيل، الجلسرين، بروموفينول الأزرق، وتريز عند 7.5 إلى 100 ميكرولترات من العينة وتحليل العينات بواسطة الكهرباء. لأداء النشاف الأمينية، وضع مرشح nitrocellulose مبللة مع 25 ملليمولار فوسفات الهيدروجين الصوديوم على هلام polyacrylamide. ضع هذه بين اثنين من مرشحات السليلوز مبللة، وأخيرا، بين اثنين من منصات البلاستيك مبللة تجوب.
ضع هذا التجميع بين أقطاب غرفة تحتوي على 25 ملليمولار فوسفات هيدروجين الصوديوم في درجة حرارة تتراوح بين درجتين وأربع درجات مئوية. نقل البروتينات الكهربائية في 20 فولت وعلى اثنين إلى ثلاثة أمبير لمدة ثلاث ساعات. سد الغشاء نيتروسيلولوسي في سد العازلة بين عشية وضحاها في درجتين مئويتين.
في اليوم التالي، احتضان nitrocellulose في 20 ملليلتر من واحد إلى 5، 000 تخفيف من المضادة له C-محطة HRP الأجسام المضادة وسد العازلة لمدة ساعتين وغسل مرتين مع 50 ملليلتر من العازلة لما مجموعه 60 دقيقة. لتصور لطخة الأمينية، تذوب ستة ملليغرام من 4-الكلورو-1-نابثول في 20 ملليلتر من الكحول المشوهة وإضافة 80 ملليلتر من 15 ملليمولار تريس و 50 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين 30٪. قم باستحمام ورقة التصفية في هذا الحل الركيزة لمدة 20 دقيقة.
عندما يكون لون كاف قد وضعت، شطف الغشاء بالماء والسماح لها لتجف. للبدء، احتضان 100 ميكرولتر aliquot من حويصلات الغشاء في 12 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إضافة العازلة 3 تحتوي على البوليامينات ذات علامة وراعية في تركيز نهائي من 50 ميكرومولار إلى غشاء vesicles في 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنابيب لبدء النقل.
إجراء عملية نقل في 12 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، نقل خليط التفاعل إلى الترشيح متعددة وتصفية من خلال مرشح غشاء نيتروسيلولوز 0.45 ميكرومتر. إضافة ثلاثة ملليلترات من الجليد الباردة العازلة المقايسة التي تحتوي على تركيز أعلى عشرة أضعاف من البوليامين غير المُشرَّم، تليها ثلاثة ملليلترات من العازلة المقايسة دون البوليامينات للحد من الربط غير المحدد.
نقل المرشحات المغسولة إلى 20 ملليلتر قنينات متألقة يمكن التخلص منها تحتوي على 10 ملليلترات من سائل التلألؤ، واستخدم عداد مُلألؤ سائل لتحديد النشاط الإشعاعي. حساب امتصاص البولي أمين صافي كما هو موضح في بروتوكول النص. تحديد كم للركيزة عن طريق قياس امتصاص الركيزة المشعة إلى فِيَضِي تعبر عن البروتين المستهدف وتحسب حركية مايكليس مينتن باستخدام أسلوب الانحدار غير الخطي.
بالنسبة لتجارب المنافسة، أضف الركيزة التنافسية غير المسماة المصنوعة في المخزن المؤقت للمختبر إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 100 ميكروليت من الفُيَسَس عند 12 درجة مئوية مع إضافة 50 ميكرومولار من البوليمين المشع في نفس الوقت. قياس النشاط الإشعاعي المحاصرين داخل الحوي كما هو موضح سابقا. تحديد الـ KM الأم للركائز التنافسية من خلال قياس امتصاص البوليامينات المشعة ووجود 100 من الركازة الدقيقة أو أعلى غير المسمى واستخدام أسلوب الانحدار غير الخطية لرسم المنحنى.
في هذه الدراسة، يتميز مضاد الحمال بالتعبير عن البروتين لأول مرة في الإشريكية القولونية، ومن ثم توليد حويصلات الغشاء بحيث يمكن تحليل البروتين غير المعبّر عنه بشكل غير مباشر في نظام خالٍ من الخلايا. يتم استخدام لطخة غربية للتحقق من أن AtBAT1 يتم نقل إلى vesicle. التحقيق في لطخة مع المضادة له C-محطة الأجسام المضادة كشفت عن بروتين بناء الانصهار الذي هو ما يقرب من 72.3 كيلودالتون.
أدى هضم الفُيصلات قبل SDS-PAGE إلى تضاؤل، ولكن ليس فقدانًا كاملًا لإشارة المسبار. في 12 درجة مئوية، امتصاص الحيوانات المنوية المشعة من قبل الفحوى هو أعلى في دقيقة واحدة وظلت خطية على مدى ثلاث دقائق. لذلك، يتم تحديد وقت الحضانة للمقايسة النقل في دقيقة واحدة.
بعد دقيقة واحدة، لا يوجد امتصاص صافي للنظائر بواسطة الأغشية التي تم إعدادها وتخزينها في 8.0 من البروتونات حيث لا يوجد تدرج في الغشاء الحوائي. لإثبات تأثير تبديد تدرج البروتون الاصطناعي ، يتم احتضان غشاء vecuicles في 8.0 درجة هيدروليكية 8.0 العازلة لمدة 10 دقائق قبل إضافة الركيزة المسماة ، مما يؤدي إلى امتصاص الحد الأدنى من الركيزة ذات العلامات الإشعاعية. معا، وهذه النتائج تشير إلى أن امتصاص البروتون يحركها من الحيوانات المنوية ويرجع ذلك إلى بروتين BAT1.
لتحديد خصوصية الركيزة للبروتين، يتم حساب قيم الـ كم بقياس امتصاص الركيزة ذات علامات الراديو بتركيزات مختلفة. تشير قيم كم لـ spermidine و putrescine وArginine إلى أن هذا البروتين هو بوليمين عالي التقارب ومبادل أرجينين. ويمكن أيضا تحديد تقارب الناقل لركيزة معينة بشكل غير مباشر باستخدام مقايسات المنافسة.
تكشف هذه الأقوال أن GABA هو مثبط تنافسي من الحيوانات المنوية. وعلاوة على ذلك، فإن قياس امتصاص 50 من الميكرومولار من الحيوانات المنوية ذات الوميض المشع في وجود تركيزات مختلفة من الأحماض الأمينية المختلفة يكشف أن AtBAT1 قادر أيضًا على نقل الغلوتامات والألانين بتركيزات المليمولار. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من الواضح أن دمج ناقل الغشاء في الغشاء البكتيري أمر بالغ الأهمية.
التحقق من أن البروتين الفائدة هو متكامل في الغشاء يمكن القيام به باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد العلامات C-المحطة الطرفية. 10- ويمكن أن يؤثر الاختلاف الوراثي في ناقلات البشر على نقل نواتج الأيض والعقاقير التي تشكل ركائز الناقل المعين. وهكذا، يمكن أن يؤثر الاختلاف الليني على امتصاص المخدرات وإفرازها على حد سواء.
يمكن إجراء العديد من المتغيرات الالية بسرعة عن طريق الطفرات الموجهة جنبًا إلى جنب من جين الناقل في متجه التعبير. يمكن بعد ذلك اختبار الفحوصات الوظيفية لهذه المتغيرات في ظل ظروف خاضعة للرقابة الشديدة باستخدام مقايسات من الداخل إلى الخارج. وتشكل ناقلات الأغشية 8 إلى 10 من جميع البروتينات ولم تتميز معظمها تماما في أي من الكائنات الحية النموذجية.
الناقلون التي يتم تحديدها إلى الأغشية العضية هي صعبة بشكل خاص لتوصيفها بالتعبير غير المتغاير في الخلايا الكاوية. إذا كان نوع التبادل أو الناقلين بوساطة البروتون يمكن أن تكون موضعية لهذا الغشاء الإشريكية القولونية، يمكن أن تكون هذه الناقلات وظيفياً مُصفة باستخدام هذا الفحص في المختبر. وتتأثر نوعية والغلة من العويصلات من معدل elution من شظايا الخلية من الصحافة الفرنسية.
في القيام بمقايسات النقل من الفينات مع النظائر ، من المهم أن يكون الإعداد التجريبي الذي يسهل القيام النسخ المتماثلة التجريبية. هناك العديد من الطرق للقيام بذلك، ولكننا نعتقد أنه سيكون من المفيد لنا أن نريك كيف فعلنا ذلك.
