يصف هذا البروتوكول تقنية جديدة للإثراء المتزامن لـ PTMs متعددة مع الأجسام المضادة متبوعة بتحليل مستقل لقياس الطيف الكتلي للاكتساب للحصول على رؤية بيولوجية في توطين الموقع والتحدّث المتبادل. هذا هو الوقت وتقنية فعالة من حيث التكلفة التي تمكن من تحديد في وقت واحد والكمية من الببتيدات مع تشريح تحتوي على أسيتيل وPTMS succinylation مع كميات صغيرة فقط من مدخلات العينة. يعد تتبع التعديلات اللاحقة للترجمة خطوة مهمة في وصف ومكافحة حالات الأمراض المختلفة.
نحن ندرك بالفعل أن بعض أنواع السرطان والسكري تخضع لتنظيمات عالية من خلال هذه التعديلات البروتينية. يمكن أن تنطبق هذه الطريقة نظريًا على أي PTMs مع الأجسام المضادة للإثراء مثل في كل مكان والفوسفور وغيرها. ويمكن أن تنطبق أيضا على أنواع الأنسجة الأخرى أو نماذج ثقافة الخلية.
مفتاح الحصول على بيانات قيمة باستخدام هذه التقنية هو إعادة التكرار. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ضمان تنفيذ جميع الخطوات بعناية فائقة وخاصة الخطوات التي تنطوي على حبات الأجسام المضادة. للبدء، والحصول على خراطيش تحتوي على الراتنج C18 التي تجمع ما يصل إلى 10 ملليغرام من البروتين.
تناسب هذه الخراطيش في جهاز فراغ. إضافة 800 ميكرولترات من 80٪ الأسيتونتريل و 0.2٪ حمض فليك إلى خراطيش مع 19.8٪ الماء وبدء شفط فراغ لسحب السائل من خلال. كرر هذه الخطوة مرة واحدة تجنب تجفيف الخراطيش تماما.
اكويبيل الخراطيش بإضافة 800 ميكرولترات من حمض 0.2٪ في الماء مع شفط الفراغ. كرر هذا مرتين. تحميل واحد ملغم الببتيدات في حوالي 1، 000 ميكرولتر حل على الخراطيش مع شفط الفراغ.
غسل الببتيدات مرتين مع 800 ميكرولترات من 0.2٪ حمض ففورميك في الماء تحت شفط فراغ. ثم ترتيب 1.5 ملليلتر أنابيب microcentuge تحت كل خرطوشة لجمع الببتيد. تحت شفط فراغ, الببتيدات من الخراطيش أولا مع 800 ميكرولتر من 80٪ الأسيتونتريل و 0.2٪ حمض ففورميك في 19.8٪ الماء ثم مع 400 ميكرولترات من نفس الحل.
جفف عينات الببتيد المزيلة تمامًا في مكثفة فراغ لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. الآن، resuspend الببتيدات المجففة في 1.4 ملليلتر من الباردة 1X من 1X من الناحية المناعية تنقية العازلة. دوامة لخلط وضمان وجود ما يقرب من 7
أجهزة الطرد المركزي العينات في 10،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بيليه صغيرة تظهر. وضع الببتيدات جانبا على الجليد أثناء إعداد حبات الأجسام المضادة.
إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني 1X الباردة إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من K-أسيتيل الطين الخرز الجسم المضاد وأنبوب يحتوي على 100 ميكرولترات من K-succinyl حبة الجسم الضد الطين ومزيج عن طريق pipetting. نقل الحل بأكمله إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر وتدور في جهاز طرد مركزي مصغرة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. التعرق برنامج تلفزيوني مع الحرص على تجنب الطامح قبالة أي حبات.
كرر غسل ثلاث مرات إضافية. المقبل ، resuspend الخرز في حوالي 440 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني. الماصات الخرز عدة مرات لخلط جيدا.
مع 200 نصائح قبل قص ميكرولتر، نقل 100 ميكرولترات من كل حبات الأجسام المضادة أسيتيليسين وحبات الأجسام المضادة succinyllysine في أنبوب جديد. تدور لأسفل لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي مصغر وpirate قبالة وسائل الإعلام مع تلميح محمل هلام. الخرز الآن تتحول إلى اللون الأبيض.
Pipette الببتيد resuspended مباشرة على الخرز غسلها واحتضان الببتيدات مع الخرز في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الانفعالات. في الصباح، تدور عينات الببتيد في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية. قم بإزالة الببتيدات غير المنضمة فائقة وحفظها للتجارب المستقبلية إذا رغبت في ذلك.
إضافة ملليلتر واحد من الباردة 1X من 1X مناعي تنقية العازلة إلى الخرز لغسل وخلط عن طريق عكس خمس مرات. تدور في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية. التبخر قبالة محلول تنقية المناعة اللانهاية وتكرار تطهير المناعة خطوة واحدة أكثر مرة أخرى.
ثم إضافة ملليلتر واحد من المياه الباردة HPLC إلى الخرز ومزيج عن طريق عكس خمس مرات. تدور في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية. التعرق قبالة الماء وتكرار المياه غسل الخطوة مرتين إضافية.
تدور مرة إضافية في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية لجمع أي ماء المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب. مع نصائح تحميل هلام مسطحة يميل، الطامح قبالة أي المياه الإضافية التي جمعت. كن حذرا لتجنب التعرق الخرز.
إضافة 55 ميكرولترات من 0.15٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك في الماء إلى الخرز. احتضان الخرز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في حين التنصت في بعض الأحيان الجزء السفلي من الأنبوب لخلط. تدور الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي مصغر.
استخدام رأس مسطحة يميل تحميل تلميح لنقل الببتيدات eluted في أنبوب جديد. إضافة 45 ميكرولترات من 0.15٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك في الماء إلى الخرز. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء النقر على الجزء السفلي من الأنبوب في بعض الأحيان لخلط.
تدور الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية في جهاز الطرد المركزي مصغرة. إزالة elution الثاني باستخدام مسطحة يميل هلام تحميل تلميح والجمع بين ذلك مع elution الأول. تدور الببتيدات المائل مجتمعة في 12، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى بيليه أي الخرز التي تحمل أكثر.
نقل حل عينة الببتيد إلى أنبوب 500 ميكرولتر جديد. بناء طريقة التحميل لتحميل خليط الببتيد المخصب على رقاقة C18 قبل العمود وseded والببتيدات مرة أخرى عن طريق غسل مع المرحلة المتنقلة A في اثنين microliters في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. بناء أسلوب الكروماتوغرافيا بحيث يتم نقل الببتيدات إلى عمود تحليلي و elute بمعدل تدفق 300 نانولتر في الدقيقة مع تدرج من ساعتين إلى ثلاث ساعات باستخدام مراحل المحمول A و B.على وجه التحديد، واستخدام التدرج الخطي من 5٪ المتنقلة المرحلة باء إلى 35٪ المرحلة المتنقلة B أكثر من 80 دقيقة.
في وقت لاحق، المنحدر المرحلة باء المحمول إلى 80٪ على مدى خمس دقائق ثم عقد في 80٪ B لمدة ثماني دقائق قبل العودة إلى 5٪ B لإعادة التوازن لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، قم بإنشاء طريقة أداة MS للحصول على بيانات تعتمد على. لتجربة واحدة، قم بإعداد فحص أيونات السلائف MS1 من M/Z 400 إلى 1,500.
تعيين المدة إلى 120 دقيقة. إنشاء تجربة IDA وانقر فوق موافق. تحت علامة التبويب معايير التبديل، تعيين عتبة كثافة لتشغيل MS / MS بمسح أيونات من الحالات المشحونة بين اثنين إلى خمسة إلى 200 العد في الثانية. تعيين استبعاد دينامية من الأيونات السلائف إلى 60 ثانية.
لتجربة اثنين، تعيين فحص أيون المنتج MS/MS مع نطاق تفحص MS2 من M/Z 100 إلى 1، 500. انقر فوق تعديل المعلمات وتعيين انتشار الطاقة الاصطدام إلى خمسة وحدد وضع المسح الضوئي للمنتج حساسية عالية أيون. وأخيراً، ضع العينة في الاختزال التلقائي.
إرسال قائمة الانتظار عينة وبدء LC-MS / MS أساليب الاستحواذ بناء أسلوب أداة MS للحصول على البيانات المستقلة وتحديد تجربتين مسح الصك. إجراء المسح الضوئي السلائف إم اس 1 ايون من 400 إلى 1، 250 كتلة لتوجيه الاتهام وتعيين المدة إلى 120 دقيقة. تعيين الطاقة الاصطدام انتشار إلى 10 وتراكم الوقت إلى 45 مللي ثانية ثم حدد وضع المسح الضوئي للمنتج حساسية عالية.
بعد ذلك، استيراد ملف نصي يحتوي على 64 متغير إطار نظام الحصول على DIA برقة لملء إطاري الاستحواذ على مساحة في الأسلوب. في مخطط الاستحواذ هذا، يتم تمرير النوافذ المتغيرة التي تتراوح بين خمسة إلى 90 كتلة إلى تهمة وعرض في خطوات تدريجية على نطاق كتلة كاملة من 400 إلى 1، 250 كتلة لتوجيه الاتهام مع ما مجموعه 64 قطعة رقعة كل مع 45 مللي ثانية وقت التراكم. ضبط الوقت تراكم MS1 إلى 0.25 ثانية.
معا، وتفحص MS1 و 64 MS2 المسح الضوئي يجب أن تسفر الآن عن دورة الوقت الكلي من 3.2 ثانية. في هذه الدراسة، وثقت النتائج التجريبية إمكانية الكشف عن وتقييم PTM عبر الحديث. يوضح هذا الجدول كيفية الجدول الزمني لسير العمل وكميات العينة والبروتين المطلوبة.
يمكن تنفيذ طريقة وعاء واحد في نصف الوقت مع نصف عدد العينات مثل هذه الطرق البديلة. وكان متوسط معامل التغير في مناطق الببتيد المعدلة أقل في طريقة الوعاء الواحد منه في إثراء PTM والمسلسل. وفي حين أن المقارنة بين الأساليب الوحيدة لإثراء الـ PTM ذات الوعاء الواحد وطرق إثراء PTM الوحيدة، لم تكن هناك اختلافات ملحوظة بين الارتباطات بين القياس الكمي على مستوى الموقع بالنسبة للتعديلين.
يعرض هذا الرقم بيانات من إثراء ناجح ويوضح مثالاً للببتيد الذي يحتوي على تعديلات acyl متعددة ومختلفة تصور PTM عبر الكلام. الببتيد كان أسيتيلات على بقايا ليسين واحدة وsuccilynated على الآخر بينما هنا كان نفس الببتيد succilynated في كل من ليسين. وهذا يدل على أن نفس بقايا ليسين يمكن تعديلها مع كل من مجموعات acylation وهناك إمكانية للتحدث المتبادل التي تحدث في هذا الموقع.
من الضروري التأكد من أن كل عينة تحتوي على نفس الكمية من الخرز وتأكد من أن أيا من الخرز يستنشق بطريق الخطأ عند غسل الخرز السندات الببتيد. يتم تنفيذ التحليل القائم على القياس الطيفي الشامل وتحليل البيانات في أدوات البرامج مثل Spectronaut بعد هذا الإجراء لتحديد وتحديد وتنفيذ توطين الموقع لـ PTMs. هذا العمل اكتساب مستقلة عن البيانات في تركيبة مع إثراء PTM المتزامنة ستفتح السبل لتقييم أكثر كفاءة PTM عبر الحديث وتقديم رؤى أفضل في أهمية PTM الإشارات.
