تشير الأدلة المتزايدة إلى تأثير إشارات الإستروجين على الجزء القولوني من علم وظائف الأعضاء ، والكيمياء المناعية هي تقنية واعدة لتحديد مستقبلات الإستروجين في القولون وتتطور إلى التهاب القولون. نقدم بروتوكول كامل ومصادق عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات الإستروجين في القولون، وذلك باستخدام الفلوروسين المناعي. جنبا إلى جنب مع Dr.Sylwia Michlewska من مختبر التصوير المجهري من جامعة لودز، وسوف نثبت الإجراء.
ضع القولون في طبق بتري. قطع القولون إلى شظايا سنتيمتر واحد إلى اثنين. ضع كل جزء على اسفنجة في كاسيت النسيجي المسمى بشكل مناسب.
ضع كاسيت يحتوي على جزء من القولون في 4٪ شبه شكلي. احتضان لمدة 24 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية. إعداد وبرمجة معالج الأنسجة لمدة ساعة واحدة من الحضانة في 50٪70٪90٪95٪و100٪ الإيثانول, الزيلين 100٪الإيثانول, والزيلين فقط, وكذلك لمدة ثلاث ساعات على الأقل من الحضانة في البارافين السائل.
نقل جزء القولون إلى مربع النسيج. ضع الصندوق في معالج الأنسجة المبرمج مسبقًا وادير المعالج. بعد الحضانة في معالج الأنسجة إزالة القولون من مربع الأنسجة ووضع جزء القولون في قالب معدني، بحيث طرفي القولون في وضع مستقيم.
ملء ثلث القالب مع البارافين السائل. ضع القالب في منطقة التبريد عند ناقص خمس درجات مئوية لبضع ثوان ثم حرك القالب إلى منطقة الاحترار عند 70 درجة مئوية. ثم ضع القالب في الجزء السفلي من مربع النسيج وتغطية جزء القولون بأكمله مع البارافين السائل.
ضع القالب المعدني الذي يحتوي على شظية القولون والبارافين في منطقة التبريد لبضع دقائق. ثم إزالة العفن المعدني من القولون وكتلة البارافين. احتضان القولون وكتلة البارافين لمدة 24 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة، وإزالة البارافين الزائد من كتلة. إدراج القولون وكتلة البارافين في microtome الروتاري مؤتمتة بالكامل. قطع شظية القولون إلى خمسة أقسام ميكرومتر.
نقل قسم القولون واحد إلى حمام مائي، محمّى إلى 40 درجة مئوية. استخدم الشريحة الزجاجية المسماة لإزالة قسم القولون من حمام الماء واحتضان الشريحة الزجاجية في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. أولاً، أزل البارافين عن طريق احتضان الشريحة الزجاجية باللون الزيلين لمدة خمس دقائق.
كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ثم ضع الشريحة الزجاجية في خليط واحد إلى واحد من الزيلين والإيثانول بنسبة 100٪لمدة خمس دقائق. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
استخدم سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة لإعادة هيدرات قسم القولون. اغمر الشريحة في الإيثانول لمدة خمس دقائق. كرر ثلاث مرات في كل تركيز قبل الانتقال إلى التركيز التالي.
شطف الشريحة الزجاجية تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق. إعادة تسخين العازلة استرجاع المستضد إلى 95 إلى 98 درجة مئوية. ثم سخني الشريحة الزجاجية في محلول استرجاع المستضد المغلي لمدة 10 دقائق.
لمنع هدر الكواشف، استخدم قلمًا مُهدّبًا لرسم دائرة حول قسم القولون. ثم، احتضان الشريحة لمدة 10 دقائق في محلول 3٪ من بيروكسيديز الهيدروجين والماء. اغسل الشريحة في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق.
ثم احتضان الشريحة في منع الحل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل حجب وإضافة 20 إلى 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ضد E-R ألفا، E-R بيتا، أو G-P-E-R المخفف. احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في الظلام.
إزالة حل الأجسام المضادة. اغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة.
احتضان الشريحة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة مع صبغ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية من الشريحة. اغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق في كل مرة.
إضافة الفلوروكرروم المخفف للتصور غشاء واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إزالة الحل وغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل لمدة خمس دقائق في كل مرة. إضافة بضع قطرات من الجلسرين المستندة إلى DAPI السائل، وهو fluorochrome لتصور نواة الخلية، مباشرة على قسم القولون.
غطّيها بعناية بشريحة الغلاف. احتضان قسم القولون لمدة 24 ساعة على الأقل عند أربع درجات مئوية. تحليل قسم القولون تحت مجهر confocal يضم أهداف 20x أو 63x والغمر النفط.
تم التحقق من خصوصية الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة باستخدام خلايا MCF-7. تمكين الأجسام المضادة مستقبلات هرمون الاستروجين الكشف عن مستقبلات الإستروجين النووية E-R ألفا وE-R بيتا، فضلا عن مستقبلات هرمون الاستروجين المرتبطة بالغشاء G-P-E-R. كما تم تنفيذ سيطرة سلبية في الخلايا التي MCF-7 كانت ملطخة فقط مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع fluorochrome وسائل القائم على الجلسرين مع DAPI.
تم العثور على إشارة قوية من السيتوبلازمية من ألفا E-R في أقسام القولون التي تم الحصول عليها من الفئران التحكم ومن الفئران مع مرض كرون الناجم عن TNBS. ومع ذلك، كان القولون فقط التي تم الحصول عليها من الفئران التحكم E-R ألفا مترجمة في سيتوبلازم خلية القبل. كشف المجهر Confocal أيضا توطين السيتوبلاسميك من بيتا E-R في أقسام القولون من كل من السيطرة والفئران المعالجة TNBS.
وبالمثل، تم توثيق توطين السيتوبلازمي لـ G-P-E-R في أقسام القولون التي تم الحصول عليها من فئران التحكم والفئران المعالجة TNBS. تحديد الموضع الصحيح للقولون في القالب ضروري لتوليد المقطع المقطع العرضية الصحيح. وينبغي اختيار الفلوروكروم من خلال الإثارة الخاصة به وطيف الانبعاثات.
ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على البروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون. يمكن تمديد الكشف المناعي للكيمياء عن طريق الفلورس المناعة إلى وصمة عار البروتينات الأخرى في حالة اتجاه البروتين البروتين.
