تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01DK120986 (إلى K.P.M.).

الآثار الظهارية للالتهاب المعوي على القولون الفئران الثابتة

<ol>
	<li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mend+your+fences:+The+epithelial+barrier+and+its+relationship+with+mucosal+immunity+in+inflammatory+bowel+disease.">Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li><li>McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+barrier+dysfunction+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).</li><li>Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+and+ex+vivo+systems+used+in+inflammatory+bowel+disease.">In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease.</a> In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).</li><li>Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease:+A+review.">Animal models of inflammatory bowel disease: A review.</a> Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).</li><li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis:+Concepts,+considerations,+and+tricks+of+the+trade.">T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).</li><li>Bhinder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Citrobacter+rodentium+mouse+model:+Studying+pathogen+and+host+contributions+to+infectious+colitis.">The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).</li><li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease.">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).</li><li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Dotti, I., Salas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+human+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+inflammatory+bowel+diseases.">Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+stem+cell+niche:+Homeostasis+and+adaptations.">The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations.</a> Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5++intestinal+stem+cells+and+their+progeny.">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li><li>Wilson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+culture+conditions+for+improved+growth+and+functional+differentiation+of+mouse+and+human+colon+organoids.">Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+intestinal+inflammation+in+DSS-induced+model+of+IBD.">Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).</li><li>Cunningham, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-&#947;+coactivator+1-&#945;+(PGC1&#945;)+protects+against+experimental+murine+colitis.">Peroxisome proliferator-activated receptor-&#947; coactivator 1-&#945; (PGC1&#945;) protects against experimental murine colitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Julian, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelium+is+more+susceptible+to+cytopathic+injury+and+altered+permeability+than+the+lung+epithelium+in+the+context+of+acute+sepsis.">Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).</li><li>Haberman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+colitis+mucosal+transcriptomes+reveal+mitochondriopathy+and+personalized+mechanisms+underlying+disease+severity+and+treatment+response.">Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response.</a> Nature Communications. 10, 38 (2019).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+plays+opposite+roles+in+the+initiation+and+progression+of+colitis-associated+cancer.">Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer.</a> Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).</li><li>Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+CMV+in+the+gut+of+HIV-infected+individuals+and+epithelial+barrier+dysfunction.">Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).</li><li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions.">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).</li><li>Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+Intestinal+mucosal+defense+and+inflammation:+Learning+from+clinical+and+experimental+studies.">Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).</li><li>Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++stem+cells+are+indispensable+for+radiation-induced+intestinal+regeneration.">Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).</li><li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+reprogramming+of+colonic+epithelium+links+ECM+remodeling+to+tissue+regeneration.">YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).</li><li>Komiya, Y., Habas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signal+transduction+pathways.">Wnt signal transduction pathways.</a> Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).</li></ol>

المؤلفون المساهمون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

أحدث تطور المواد العضوية ثورة في الطريقة التي يدرس بها المجتمع العلمي أنظمة الأعضاء في المختبر مع القدرة على تلخيص البنية الخلوية والوظيفة جزئيا من أو إنسان في طبق. علاوة على ذلك ، توفر الأنظمة العضوية المشتقة من البشر المصابين بأمراض أداة واعدة للطب الشخصي الذي يمكن أن يوجه عملية صن...

مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض مزمن وتحويل وانتكاس يتميز بنوبات من الالتهاب والسكون السريري. مسببات مرض التهاب الأمعاء متعددة العوامل ، ولكن السمات المميزة الرئيسية للمرض تشمل وظيفة الحاجز المعيب وزيادة نفاذية ظهارة الأمعاء ، بالإضافة إلى شلالات الإشارات الالتهابية التي يتم تنشيطها داخل المقصورة الظهارية 1,2. تم استخدام العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتلخيص الاستجابة الظهارية أثناء مرض التهاب الأمعاء ، بما في ذلك زراعة الخلايا ونماذج الفئران للالتهاب3. ومع ذلك ، فإن كل هذه الأنظمة لديها أوجه قصور مهمة تحد من قدرتها على تلخيص التغيرات الظهارية خلال IBD4. يتم تحويل معظم خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، ولديها القدرة على تكوين طبقة أحادية ، ويمكن أن تفرق3 ولكنها تنتشر جوهريا بشكل مختلف عن الخلايا الظهارية المعوية غير المحولة في المضيف. يتم استخدام العديد من نماذج الفئران المختلفة للالتهاب لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، وبعضها يشمل نماذج خروج المغلوب ، والنماذج المعدية ، والنماذج الالتهابية الكيميائية ، ونماذج نقل الخلايا التائية5،6،7،8. في حين أن كل منها يمكنه دراسة بعض الجوانب المسببة لمرض التهاب الأمعاء ، مثل الاستعدادات الوراثية ، واختلال الحاجز ، وإلغاء التنظيم المناعي ، والميكروبيوم ، إلا أنها محدودة في قدرتها على دراسة الطبيعة متعددة العوامل للمرض.
تم إنشاء الكائنات العضوية المعوية ، بما في ذلك الأمعاء والقولون ، على مدار العقد الماضي كنموذج مفيد في المختبر لدراسة ليس فقط ديناميات الخلايا الجذعية المعوية ولكن أيضا دورها في سلامة الحاجز ووظيفة ظهارة الأمعاء في التوازن المعوي والمرض. ساهمت هذه الكيانات بشكل كبير في فهمنا للتسبب في مرض التهاب الأمعاء9 وفتحت فرصا جديدة للطب الشخصي. تم تطوير القولون ، أو مزارع الأنسجة ذاتية التنظيم المشتقة من الخلايا الجذعية من القولون ، من كل من الفئران والأنسجة البشرية في عملية تسمح للخلايا الجذعية الموجودة داخل الخبايا المعوية بالتكاثر والحفاظ عليها إلى أجل غير مسمى10. يعتمد تخصص الخلايا الجذعية في الجسم الحي على عوامل خارج الخلية لدعم نموه ، ولا سيما إشارات Wnt المتعارف عليها ومسارات إشارات البروتين المورفوجيني للعظام11. إن إضافة هذه العوامل تعزز صحة وطول عمر القولون ولكنها تدفع أيضا الثقافة نحو حالة تشبه الخلايا الجذعية لا تعكس البنية الخلوية الظهارية في الجسم الحي ، والتي تتكون من خلايا ذاتية التجديد ومتمايزة نهائيا12,13. في حين أن وظيفة ظهارة الأمعاء تعتمد على الحديث المتبادل المستمر بين حجرة الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة ، فإن القدرة على الحصول على كليهما في نظام زراعة القولون محدودة إلى حد ما. على الرغم من هذه القيود ، يظل نظام الاستزراع العضوي هو المعيار الذهبي لدراسة الخصائص الجوهرية للظهارة خارج الجسم الحي. ومع ذلك ، قد يلزم النظر في استراتيجيات الثقافة البديلة للإجابة على السؤال العلمي المطروح.
لقد ثبت أن الفئران التي تتبع نظاما مستمرا لمدة 7 أيام من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) تصاب بالتهاب ظهاري وخلل في الحاجز14. علاوة على ذلك ، تم أيضا التقاط فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا وإعادة البرمجة الأيضية داخل ظهارة الأمعاء ، والتي ثبت أنها واضحة في مرض التهاب الأمعاء البشري ، في نموذج DSS هذا لالتهاب القولون15. ومع ذلك ، توضح بياناتنا الأولية أن خصائص فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا لا يتم الاحتفاظ بها في القولون المشتق من خبايا الحيوانات المعالجة ب DSS (الشكل التكميلي 1). وبالتالي ، يجب استخدام طرق الثقافة البديلة عند فحص كيفية دفع الالتهاب للتغيرات الظهارية أثناء التهاب الأمعاء الفئران. هنا ، نحدد بروتوكولا قمنا بتطويره يصف 1) كيفية عزل الخبايا من أنسجة القولون الكاملة لإنشاء قولون الفئران ، 2) كيفية التمييز النهائي بين هذه الخلايا لتعكس عدد الخلايا كما هو الحال في الجسم الحي ، و 3) كيفية إحداث التهاب في هذا النموذج في المختبر . لدراسة التفاعلات الدوائية داخل الظهارة الملتهبة ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء طبقات أحادية 2-dimensonal (2D) من قولون الفئران التي يمكن علاجها بشكل أساسي باستخدام وسطاء التهابيين ومعالجتها قميا بالعلاجات الدوائية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4-&#956;M transparent transwell, 24-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#956;M cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76327-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopsticks Electrode Set for EVO</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel GFR Membrane Mix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354-230</td>
			<td>Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11960-069</td>
			<td>Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11150H</td>
			<td>Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-ga-1</td>
			<td>Final Concentration (400 &#181;g/&#181;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco/Fisher</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 &#956;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1 M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hIFN&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF</td>
			<td>Stock Concentration (1000 ng/&#181;L); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hIL-1&#946;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>201-LB</td>
			<td>Stock Concentration (10 ng/&#181;L); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td>Stock Concentration (10 ng/&#181;L); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B Gold</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-hg-1</td>
			<td>Final Concentration (400 &#181;g/&#181;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-35176</td>
			<td>Stock Concentration (0.5 &#181;g/&#181;L); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock Concentration (0.1 ng/&#181;L); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>5666-2160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration (0.25 &#181;g/&#181;L); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryp LE Express</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Water&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihyddrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 &#181;M); Solvent (UltraPure Water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the epithelial effects of intestinal inflammation in vitro on established murine colonoids

تلعب ظهارة الأمعاء دورا أساسيا في صحة الإنسان ، حيث توفر حاجزا بين المضيف والبيئة الخارجية. توفر طبقة الخلايا عالية الديناميكية هذه خط الدفاع الأول بين المجموعات الميكروبية والمناعية وتساعد على تعديل الاستجابة المناعية المعوية. اضطراب الحاجز الظهاري هو السمة المميزة لمرض التهاب الأمعاء (IBD) وهو ذو أهمية للاستهداف العلاجي. نظام زراعة القولون 3 الأبعاد هو نموذج مفيد للغاية في المختبر لدراسة ديناميات الخلايا الجذعية المعوية وفسيولوجيا الخلايا الظهارية في التسبب في مرض التهاب الأمعاء. من الناحية المثالية ، فإن إنشاء القولون من الأنسجة الظهارية الملتهبة للحيوانات سيكون أكثر فائدة في تقييم التأثيرات الجينية والجزيئية على المرض. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن التغيرات الظهارية في الجسم الحي لا يتم الاحتفاظ بها بالضرورة في القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران المصابة بالتهاب حاد. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير بروتوكول لعلاج القولون بمزيج من الوسطاء الالتهابيين الذين عادة ما يكونون مرتفعين أثناء مرض التهاب الأمعاء. في حين يمكن تطبيق هذا النظام في كل مكان على ظروف الثقافة المختلفة ، فإن هذا البروتوكول يؤكد على العلاج على كل من القولون المتمايز والطبقات أحادية الأبعاد 2 المشتقة من القولون الثابت. في بيئة الثقافة التقليدية ، يتم إثراء القولون بالخلايا الجذعية المعوية ، مما يوفر بيئة مثالية لدراسة مكانة الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، لا يسمح هذا النظام بتحليل ميزات فسيولوجيا الأمعاء ، مثل وظيفة الحاجز. علاوة على ذلك ، لا توفر القولونات التقليدية الفرصة لدراسة الاستجابة الخلوية للخلايا الظهارية المتمايزة نهائيا للمنبهات الالتهابية. توفر الطرق المعروضة هنا إطارا تجريبيا بديلا لمعالجة هذه القيود. يوفر نظام الثقافة أحادية الطبقة 2 الأبعاد أيضا فرصة لفحص الأدوية العلاجية خارج الجسم الحي. يمكن علاج هذه الطبقة المستقطبة من الخلايا بوسطاء التهابيين على الجانب القاعدي من الخلية وبالتزامن مع العلاجات المفترضة قميا لتحديد فائدتها في علاج مرض التهاب الأمعاء.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic, remitting, and relapsing disease characterized by episodes of inflammation and clinical quiescence. The etiology of IBD is multifactorial, but key characteristic features of the disease include defective barrier function and increased permeability of the intestinal epithelium, in addition to proinflammatory signaling cascades activated within the epithelial compartment1,2. Several in vitro and in vivo models have been used to recapitulate the epithelial response during IBD, including cell culture and murine models of inflammation3. However, all these systems have important shortcomings that limit their ability to recapitulate the epithelial changes during IBD4. Most cell lines used to study IBD are transformed, have the ability to form a monolayer, and can differentiate3 but intrinsically propagate differently than non-transformed intestinal epithelial cells in the host. Several different murine models of inflammation are used to study IBD, some of which include knockout models, infectious models, chemical inflammatory models, and T-cell transfer models5,6,7,8. While each can study certain etiological aspects of IBD, such as genetic predispositions, barrier dysfunction, immune deregulation, and the microbiome, they are limited in their ability to study the multifactorial nature of the disease.
Intestinal organoids, including enteroids and colonoids, have been established over the last decade as a useful in vitro model for studying not only the dynamics of intestinal stem cells but also their role the barrier integrity and function of the intestinal epithelium play in intestinal homeostasis and disease. These entities have significantly contributed to our understanding of the pathogenesis of IBD9 and have opened new opportunities for personalized medicine. Colonoids, or stem cell-derived, self-organizing tissue cultures from the colon, have been developed from both murine and human tissue in a process that allows stem cells located within intestinal crypts to propagate and be maintained indefinitely10. The stem cell niche in vivo relies on extracellular factors to support its growth, notably the canonical Wnt signaling and bone-morphogenic protein signaling pathways11. The addition of these factors promotes the health and longevity of colonoids but also drives the culture toward a stem cell-like state that is not reflective of the in vivo epithelial cellular architecture, which consists of both self-renewing and terminally differentiated cells12,13. While the functionality of the intestinal epithelium is dependent upon the continual crosstalk between the stem cell compartment and differentiated cells, the ability to have both in a colonoid culture system is fairly limited. Despite these limitations, the organoid culture system remains the gold standard to study the intrinsic properties of the epithelium ex vivo. Nonetheless, alternative culture strategies may need to be considered to answer the scientific question at hand.
It has been shown that mice on a continuous 7 day regimen of dextran sodium sulfate (DSS) develop both epithelial inflammation and barrier dysfunction14. Furthermore, mitochondrial biogenesis failure and metabolic reprogramming within the intestinal epithelium, which have been shown to be evident in human IBD, have also been captured in this DSS model of colitis15. However, our preliminary data demonstrate that the characteristics of mitochondrial biogenesis failure are not retained in colonoids derived from the crypts of DSS-treated animals (Supplementary Figure 1). Thus, alternative culture methods must be used when examining how inflammation drives epithelial changes during murine intestinal inflammation. Here, we outline a protocol we have developed that describes 1) how to isolate crypts from whole colonic tissue for the establishment of murine colonoids, 2) how to terminally differentiate this cell population to reflect the cell population as it stands in vivo, and 3) how to induce inflammation in this in vitro model. To study drug interactions within the inflamed epithelium, we have developed a protocol to establish 2-dimensonal (2D) monolayers from murine colonoids that can be basally treated with inflammatory mediators and apically treated with drug therapies.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة الآثار الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران المنشأة  

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

Through our research, we aim to explore how murine colonoids could be modified from a conventional colonoid culture system, to study certain aspects of intestinal physiology and their alteration in the presence of an inflamed disease state. Studying barrier function and intestinal physiology in disease states like inflammatory bowel disease is limited when using a traditional murine colonoid culture system that reflects only stem cell physiology. Our protocol is advantageous in that it provides the reader with multiple techniques to study how inflammatory mediators affect the intestinal epithelium, by either terminally differentiating them, or creating a 2D monolayer system.In the future, our laboratory will concentrate on comprehending how the human colonoid culture system can be altered to investigate different aspects of intestinal physiology and diseases, particularly inflammatory bowel disease.

نظام ثقافة القولون المعوي 3D هو أداة لا تقدر بثمن لدراسة المساهمة الجوهرية للظهارة في توازن الغشاء المخاطي في الأمعاء. يوفر البروتوكول الموصوف تعليمات مفصلة حول كيفية عزل الخبايا من الفئران C57BL / 6J (WT) في عمر 8 أسابيع وإنشاء نظام زراعة القولون طويل الأجل يمكن معالجته لتطبيقات متعددة في المصب...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids at JoVE.com

وصفنا بروتوكولا يوضح بالتفصيل عزل خبايا القولون الفئران لتطوير القولون ثلاثي الأبعاد. يمكن بعد ذلك تمييز القولون الثابت بشكل نهائي ليعكس التركيب الخلوي لظهارة المضيف قبل تلقي تحد التهابي أو توجيهه لإنشاء طبقة أحادية ظهارية.

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

من خلال بحثنا ، نهدف إلى استكشاف كيف يمكن تعديل القولون الفئران من نظام زراعة القولون التقليدي ، لدراسة جوانب معينة من فسيولوجيا الأمعاء وتغييرها في وجود حالة مرض ملتهبة. إن دراسة وظيفة الحاجز الواقي وفسيولوجيا الأمعاء في الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء محدودة عند استخدام نظام زراعة القولون التقليدي للفئران الذي يعكس فسيولوجيا الخلايا الجذعية فقط. بروتوكولنا مفيد لأنه يوفر للقارئ تقنيات متعددة لدراسة كيفية تأثير الوسطاء الالتهابيين على ظهارة الأمعاء ، إما عن طريق تمييزها بشكل نهائي ، أو إنشاء نظام أحادي الطبقة 2D.في المستقبل ، سيركز مختبرنا على فهم كيفية تغيير نظام زراعة القولون البشري للتحقيق في جوانب مختلفة من فسيولوجيا الأمعاء والأمراض ، وخاصة مرض التهاب الأمعاء.

studying-epithelial-effects-intestinal-inflammation-vitro-on

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

741 Views.  UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh. من خلال بحثنا ، نهدف إلى استكشاف كيف يمكن تعديل القولون الفئران من نظام زراعة القولون التقليدي ، لدراسة جوانب معينة من فسيولوجيا الأمعاء وتغييرها في وجود حالة مرض ملتهبة. إن دراسة وظيفة الحاجز الواقي وفسيولوجيا الأمعاء في الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء محدودة عند ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: دراسة الآثار الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران المنشأة  

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Intestinal Epithelial Monolayers Derived from Established Murine Colonoids

Begin by preparing all the reagents prior to the experiment and thaw the basement membrane matrix on ice. Then prepare the murine monolayer medium. Dilute the thawed basement membrane one to 20 with the cold murine monolayer medium, and keep it on ice.Place a 0.4 micrometer transparent cell culture insert, using sterile forceps, into a single well of a 24 well tissue culture plate. Grab a corner prong of the insert and transfer it into the well. Repeat until the appropriate number of cell culture inserts are available for culture.To cover the apical surface of each cell culture insert with diluted basement membrane matrix, place the tip of the P 200 pipette in the center of the insert and expel 150 microliters matrix. Then, transfer the plate to a sterile 37 degrees incubator with 5%carbon dioxide, for at least one hour. At the end of the incubation, rotate the 24 well plate at a 45 degree angle.Place a single finger on the corner of the prong to stabilize the insert. Gently place the P 200 pipette tip along the bottom side of the insert and remove the basement matrix. Remove any excess residue by washing each cell culture insert with 150 microliters of sterile DPBS without calcium or magnesium ions and allow them to dry in a biological safety cabinet for a minimum of 10 minutes.Once the inserts are dried, add 400 microliters of the murine monolayer medium to the bottom, and 75 microliters on top of the cell culture insert. Repeat until all the cell culture inserts are immersed. Leave the plate in the biological safety cabinet or the incubator until needed.Then remove the 24 well plate of mature intestinal colonoids from the incubator and place it under the biological safety cabinet. Aspirate the medium using sterile tips and wash each well with one milliliter of sterile DPBS at room temperature. Using sterile tips, remove the DPBS without calcium or magnesium ions.Digest each plug of the basement membrane matrix by adding 500 microliters of enzymatic dissociation reagent in each well to be passaged. To break up the plug, rotate the 24 well plate at a 45 degree angle. Place the tip of the pipette at the edge of the plug and gently dislodge it by pipetting each plug approximately six to 10 times.Place the 24 well plate back in a sterile incubator at 37 degrees with 5%carbon dioxide, for three to four minutes. After incubation, pipette the trypsin up and down five to seven times for each well under a biological safety cabinet. Transfer the dissociated colonoids from each well into a sterile 15 milliliter conical tube and bring up to a volume of 10 milliliters with an ice cold mouse wash medium.Next, centrifuge the partially digested colonoids at 300 G for five minutes at four degrees Celsius in a swinging bucket centrifuge. Under the biological safety cabinet, remove the supernatant from the pellet using a 10 milliliter pipette. Also, remove any remaining medium using a P 200 pipette.Then, re-suspend the colonoid pellet by adding 75 microliters of murine monolayer medium. Dispense 75 microliters of the colonoid suspension to the center of each cell culture insert. Gently pipette the suspension once or twice before adding it to the well to ensure uniform platting.Place the 24 well plate with cell culture inserts on a rotating platform for 10 minutes to allow for uniform dispersion across the cell culture insert, before placing the plate in a sterile 37 degree Celsius in 5%carbon dioxide incubator. At the end of the incubation, dislodged the unattached colonoids fragments by placing the tip alongside the inside of the cell culture and pipetting the medium three to five times with a P 200 pipette. Avoid disrupting the attached intestinal cells.Remove the medium and colonoid mixture immediately. Repeat until all the cell culture inserts have been cleaned. Now add 150 microliters of pre-warmed murine monolayer medium to the apical side of each cell culture insert.Add 400 microliters of warmed murine monolayer medium to each well of a new 24 well plate. Transfer the cell culture insert to the new plate by grabbing its prong using sterile forceps. Change the medium every other day until the desired confluency is attained.The enzymatically disrupted colonoids plated on the cell culture inserts initially appeared in cellular clusters ranging from 15 to 150 cells. On day three, the cells flattened out and slowly covered the cell culture insert, generally reaching confluency. Over the next couple of days, monolayers continued to grow and formed a continuous barrier that can be quantitatively measured.