وصفنا بروتوكولا لتشريح أدمغة ذبابة الفاكهة وصبغها المناعي وجبل اليرقات والبالغين مع التركيز بشكل خاص على الفصوص البصرية. بالنظر إلى التنظيم ثلاثي الأبعاد المعقد للفص البصري ، من المتوقع أن يوفر البروتوكول الموصوف هنا للباحثين فهما أكبر للعلاقة بين اتجاه التركيب وهياكل الفص البصري المرئية. يصف هذا البروتوكول ثلاث استراتيجيات تركيب لكل من الفصوص البصرية اليرقية والبالغة ، كل منها يوفر زاوية مثالية لتصور بنية فص بصري معينة أثناء التصوير.
قبل البدء في التشريح ، املأ جميع آبار صفيحة الآبار الثلاثة ب 400 ميكرولتر من PBS لكل بئر ، واستخدم الملقط لاختيار 15 يرقة ثالثة متجولة تزحف برفق داخل قارورة أو زجاجة ذبابة الفاكهة. ضع جميع اليرقات في البئر الأول من صفيحة الآبار الثلاثة ، وانقل يرقة واحدة إلى البئر الأوسط للوحة. باستخدام اليد غير المهيمنة ، قم بتقييد جسم اليرقة عند قاعدة البئر واستخدم اليد المهيمنة للإمساك برفق بخطاف فم اليرقة.
اسحب خطاف الفم بعيدا عن الجسم لإزالة الدماغ. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الملحقة ، بما في ذلك الأقراص الوهمية. ثم ضع الدماغ في البئر الثالث من اللوحة.
عندما يتم تشريح جميع الأدمغة ، استخدم ماصة P200 لإزالة PBS بعناية من البئر الثالث ، تاركا حلا كافيا لإبقاء الدماغ مغمورا. أضف 500 ميكرولتر من محلول التثبيت البارد الطازج إلى البئر. حرك المحلول برفق بالملقط حتى يدور الدماغ في الطبق ، وقم بتغطية البئر بشريحة مجهر زجاجية.
ثم ضع الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة لإصلاح الأنسجة. اغسل العقول خمس مرات باستخدام 400 ميكرولتر من PBS الطازج بالإضافة إلى تريتون لكل غسلة. الأدمغة جاهزة الآن لحضانة الأجسام المضادة الأولية.
بالنسبة لتشريح دماغ البالغين ، قم بتخدير 10 إلى 15 ذبابة بالغة ووضعها في المختبر فوق الثلج. استخدم ملقط لنقل ذبابة بالغة برفق من الجناح إلى بئر واحد من لوحة تشريح ثلاثة آبار تحتوي على 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. استخدم زوجا من الملقط في اليد غير المهيمنة لتثبيت صدر الذبابة على قاعدة البئر ، واستخدم ملقط فائق الدقة باليد المهيمنة لسحب الرأس برفق من بقية الجسم.
تخلص من الجسم على مناديل المختبر باليد غير المهيمنة واستخدم اليد المهيمنة لتثبيت الرأس على قاعدة البئر بواسطة خرطوم. استخدم كلا الملقط لتقشير كل منطقة من بشرة بين العينين ، حتى ينكشف الدماغ ، وإزالة أي أنسجة ملحقة تظل ملتصقة بالدماغ. ضع الدماغ النظيف في البئر الثالث وقم بتشريح الدماغ التالي كما هو موضح ، حتى يتم الحصول على 15 دماغا ، أو انقضاء فترة تشريح قصوى تبلغ 30 دقيقة.
ثبت الأدمغة ب 500 ميكرولتر من محلول التثبيت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل الأدمغة خمس مرات باستخدام PBS plus triton ، كما هو موضح. أدمغة البالغين جاهزة الآن لحضانة الأجسام المضادة الأولية. استبدل الغسلة الأخيرة بقطرتين من وسيط التركيب الآمن الفلوري لغمر الأدمغة ، وأضف قطرة واحدة من وسيط التثبيت إلى وسط شريحة مجهر زجاجي جديدة.
استخدم ملقط للإمساك بكل دماغ يرقيري بواسطة الحبل العصبي البطني لنقله إلى الشريحة. لتصور السلف والخلايا العصبية من المنطقة المركزية لمركز الانتشار الخارجي ، الصفيحة أو سدادة الفصيص ، تأكد من أن الحبل العصبي البطني يبرز فوق الفصوص ، ضع أدمغة اليرقات على الشريحة مع توجيه الجانب الأمامي من الأنسجة لأعلى. لتصور الخلايا التي تنتمي إلى أطراف مراكز الانتشار الخارجية أو الداخلية ، تأكد من أن الحبل العصبي البطني يخرج من تحت الفصوص.
ضع أدمغة اليرقات على الشريحة بحيث يكون الجانب الخلفي من الأنسجة متجها لأعلى. لتصور هلال الخلايا العصبية من مراكز الانتشار الداخلية والخارجية في كل من المحور الجانبي البطني الظهري والإنسي ، استخدم زوجا من الملقط الحاد أو إبرة التنغستن لتقسيم فصوص الدماغ لأسفل عبر الحبل العصبي البطني ، بدءا من نقطة الانقسام بين الفصوص. أعد توجيه كل فص بحيث يكون الجانب الجانبي متجها لأعلى.
عندما تكون أدمغة اليرقات موجهة بشكل مناسب ، ضع قطرة صغيرة من الوسائط المتصاعدة على جانبي الدماغ. ضع زلة غطاء واحدة على كل قطرة ، وضع زلة غطاء نهائية على الأدمغة بحيث تستقر الحواف اليمنى واليسرى على زلتي الغطاء الأخريين ، لتشكيل جسر انزلاق الغطاء. ثم استخدم طلاء الأظافر لإغلاق حواف جسر انزلاق الغطاء لتأمين الأدمغة المركبة.
بعد آخر غسل ثانوي للأجسام المضادة ، قم بإجراء غسل نهائي باستخدام 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. استبدل PBS بثلاث قطرات من وسيط التركيب الآمن للفلورسنت لغمر الأدمغة. أضف قطرة من وسائط التركيب إلى الثلثين الأيسر والأيمن من شريحة المجهر الزجاجي.
ضع غطاء منزلق فوق كل قطرة لبناء جسر انزلاق غطاء. أغلق الحواف الخارجية لانزلاق الغطاء الأيمن بطلاء الأظافر وأضف قطرة واحدة من وسائط التثبيت بين زلات الغطاء. باستخدام الملقط ، انقل العقول برفق إلى الشريحة بحذر إضافي لمنع إتلاف الفصوص البصرية.
لتصور أجسام خلايا الصفيحة والخلايا العصبية النخاعية ، استخدم إبرة التنغستن لتوجيه الأدمغة في وضع أمامي مع بروز فصوص الهوائي للخارج. لتصور الخلايا العصبية لمجمع الفصيص ، قم بتوجيه الأدمغة في الخلف مع توجيه فصوص الهوائي لأسفل مقابل موضع الانزلاق. لتصور جميع الخلايا العصبية للفص البصري في مستوى واحد ، قم بتوجيه الأدمغة في وضع أفقي ، واصطف الأدمغة في حامل أمامي ، ثم استخدم إبرة التنغستن لتدوير كل دماغ 90 درجة لأعلى بحيث يجلس على جانبه البطني ، ويستريح على حافة انزلاق الغطاء.
عندما يتم توجيه أدمغة البالغين بشكل مناسب ، ضع غطاء نهائيا على الأدمغة بحيث تتداخل الحواف اليمنى واليسرى مع زلتي الغطاء الأخريين لتشكيل جسر ، وختم الشريحة بطلاء الأظافر. فيما يلي صورة لفص بصري يرقي في اتجاه التركيب الأمامي. في اتجاه التركيب الأمامي ، تظهر ظهارة مركز الانتشار المركزي الأعلى صوتا ، والخلايا العصبية النخاعية والخلايا العصبية الصفيحية على السطح كمجموعات من الخلايا التي تلتف حول الدماغ.
في عمق الدماغ ، في منتصف مكدس Z ، تكون ظهارة مركز الانتشار الخارجي الرئيسي والخلايا العصبية والخلايا العصبية الخاصة بها مرئية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر ظهارة مركز الانتشار الداخلي والخلايا العصبية لسدادة الفصيصة في هذه الشرائح الوسيطة. تصور أعمق شرائح Z الجانب الآخر من الدماغ حيث توجد الأطراف الخلفية لمركز الانتشار الخارجي.
الطرف السطحي لمركز الانتشار الداخلي موجود أيضا. لاحظ أن هذه ستكون أول الهياكل المرئية إذا تم تركيب الفص البصري خلفيا. هذه صورة من فص بصري مثبت على جانبه.
على سطح الحامل الجانبي ، يكون هلال الصفيحة مرئيا ويقع هلال سدادة الفصيص بين ذراعيه. يظهر الهلال العصبي النخاعي في موضع Z أعمق قليلا. هذه صورة لفص بصري بالغ مثبت في اتجاه أمامي.
نظرا لأن النخاع يقع على سطح الحامل الأمامي ، فإن قشرة النخاع تكون مرئية على الفور. تقوم أجسام الخلايا في القشرة بإسقاط تشجيراتها في neuropil ، والتي يمكن تصورها في موضع Z وسيط. يظهر الفصيص أيضا في هذا المستوى ، موجها بشكل عمودي على النخاع.
في أعمق موضع Z ، العصب النهائي للفص البصري ، تكون صفيحة الفصيص مرئية. لاحظ أن صفيحة الفصيص ستكون أول هيكل مرئي في الحامل الخلفي. فيما يلي صورة لفص بصري بالغ مثبت في اتجاه أفقي.
عندما ينقلب الدماغ 90 درجة على جانبه إلى وضع أفقي ، تكون جميع الخلايا العصبية والقشرية في الفص البصري مرئية في مستوى واحد. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، فإن أهم شيء يجب تذكره هو الحفاظ على أنسجة المخ مغمورة في محلول طوال البروتوكول. إذا تعرضت الأدمغة للهواء ، فإن جودة البقعة ، وبالتالي ، سيتم تقليل الصور النهائية بشكل كبير.
يعد فهم كيفية تأثير اتجاه التركيب على تصور الفص البصري أمرا مهما للتصوير الحي. يمكن زراعة أدمغة اليرقات والبالغين وتصويرها على مدار عدة أيام لمتابعة انقسامات الخلايا أو التغيرات في مورفولوجيتك الخاصة. هنا ، يعد اتجاه التركيب أمرا بالغ الأهمية ، حيث يجب أن تكون أنواع الخلايا ذات الأهمية قريبة من انزلاق الغطاء للكشف الأمثل عن إشارة الفلورسنت في الجسم الحي.
