إصابة جرح الطعنة هي طريقة إصابة ميكانيكية تحفز الاستئصال الخلوي غير المحدد. تسهل هذه الطريقة تقييم انتشار RGC والتمايز بعد إصابة الدماغ. إصابة جرح الطعنة بوساطة الإبرة هي طريقة بسيطة يتم تنفيذها بكفاءة للحث على إصابة الدماغ.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من العينات التجريبية باستخدام مجموعة قياسية من الأدوات. تم توضيح القدرة التجديدية لسمك الزرد باستخدام نموذج إصابة جرح الطعنة. تساهم رؤى جديدة في الآلية الجزيئية التي تنظم تجديد الخلايا العصبية في العلاج التجديدي في الجهاز العصبي المركزي.
ابدأ بوضع سمكة الزرد البالغة المخدرة أو ميداكا على صينية الستايروفوم. ثبت السمكة في وضع مستقيم بين إبرتين بقياس 30 يتم إدخالهما عموديا في الستايروفوم. أمسك جسم السمكة لمنع رأس السمكة من الحركة ، ثم أدخل إبرة قياس 30 عموديا عبر الجمجمة في المنطقة الإنسية لأحد كرات القفص البصري.
بعد ذلك ، قم بنقل الأسماك المصابة إلى حوض للأسماك بمياه منشأة الأسماك العذبة. بمجرد أن تتعافى الأسماك تماما من التخدير ، انقل الخزان إلى نظام التكاثر. ضع مناشف ورقية على صينية الستايروفوم لوضع السمك المخدر.
ثم ثبت جسم السمكة في مكانه عن طريق إدخال إبرتين من عيار 30 عموديا على جانبي الزعنفة الشرجية. بمجرد وضع السمكة ، قم بعمل شق بطني من فتحة الشرج إلى القلب. حافظ على القلب مرئيا عن طريق إدخال إبرتين قياس 30 على كل جانب.
ثم استخدم طرف الملقط لإزالة الطبقة الظهارية الفضية. أدخل إبرة قياس 30 في البطين ، مع إبقاء الشطبة لأعلى ، وقم بعمل شق في الأذين باستخدام الملقط. بعد ذلك ، ادفع PBS إلى الأذين عن طريق الضغط لأسفل على المحقنة لطرد الدم من الأذين.
عندما يتم تصريف الدم وتتحول الخياشيم إلى اللون الأبيض ، أوقف نضح PBS. في وقت لاحق ، قم بإزالة الإبر التي تثبت جسم السمكة في مكانها ، وقم بتثبيت الجانب البطني للأسماك لأسفل. بعد قطع الحبل الشوكي وإزالة الجمجمة من القفص البصري والدماغ الدماغي ، قم بقطع الأعصاب البصرية وتشريح الدماغ.
بعد ذلك ، انقل الأدمغة إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر مع ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني ، لإصلاحه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الأدمغة الثابتة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منها ، انقل الأدمغة إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر مع ملليلتر واحد من وزن 30٪ من حجم السكروز في برنامج تلفزيوني كواقي للتبريد ، واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد مركب التضمين عن طريق الجمع بين 30٪ سكروز مع 30 ملليلتر من درجة حرارة القطع المثلى ، أو OCT ، مركب ، وتخزين المركب عند أربع درجات مئوية.
لتبريد cryomold مرة واحدة ، احتضن كتلة من الألومنيوم طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وضع الكتلة المبردة مسبقا في صندوق الستايروفوم بغطاء لمنع الاحترار. بالنسبة للأقسام الإكليلية ، قم بتضمين الدماغ المقطعي في cryomold عن طريق ضبط الاتجاه باستخدام ملقط تحت المجهر. بعد ذلك ، ضع cryomold على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا في صندوق الستايروفوم ، واترك مركب OCT يتجمد ويصبح أبيض.
عندما يتجمد المركب ، ضع دائرة صغيرة من مركب OCT على قرص عينة قبل تركيب كتلة التبريد على قرص العينة. عن طريق وضع قرص العينة في cryostat ، قم بتجميد مركب OCT. ثم ضع قرص العينة على رأس العينة في جهاز التبريد.
بعد ضبط اتجاه كتلة التبريد ، قم بقص OCT لإزالة أي مناطق إضافية. قم بقص المقاطع التسلسلية بسمك 14 ميكرومتر من خلال القفص البصري بالكامل باستخدام cryostat ، وقم بتخزين الشرائح عند 25 درجة مئوية تحت الصفر. تم تقييم انتشار الخلايا الدبقية الشعاعية ، أو RGC ، في أنسجة المخ من الزرد.
كانت معظم RGCs تتكاثر مستضد الخلية سلبيا في نصف الكرة غير المصاب المقابل. في يومين بعد الإصابة ، تم تحفيز انتشار RGC على الجانب المصاب من medaka tectum. بعد إصابة الدماغ ، تم تقييم نسب الخلايا وتمايز RGC باستخدام برومودوكيوريدين ، أو BrdU ، وضع العلامات.
يظهر التحليل التمثيلي الخلايا العصبية حديثي الولادة في سبعة أيام بعد الإصابة في الزرد المصاب و medaka. واحدة من الخطوات الحاسمة في إصابات جرح الطعنات هي إدخال الإبرة يدويا. الإصابة المستمرة ضرورية لخلق نتائج قابلة للتكرار.
الأصباغ الفلورية فعالة كعلامات للجرح. يشير مدى انتشار صبغة الفلورسنت إلى موقع وعمق إصابة جرح الطعنة. ومن المحتمل أن تتكيف هذه التقنية مع أنواع الأسماك الصغيرة الأخرى، ويسمح التكيف مع الميداكا بإجراء مقارنات بين القدرة على التجدد.
