وهذا البروتوكول مفيد لحفظ البويضات القططية على المدى الطويل من خلال تقنية الحفظ بالتبريد المعروفة باسم التزجيج، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الخصوبة والتنوع البيولوجي في الأنواع الحيوانية. المزايا الرئيسية للاختراق هي سرعتها حيث يمكن الانتهاء منها في أقل من 17 دقيقة وجدوى في ظروف الحقل إذا كان النيتروجين السائل متوفراً. القط المحلي هو نموذج قابل للتطبيق للقطط المهددة بالانقراض البرية.
ومن شأن تطوير بروتوكولات حفظ التبريد وتحسينها أن يسمحا بإنشاء بنوك حيوية للألعاب الحيوية لبرامج الحفاظ على القطط. تبدأ من خلال إعداد لوحة repro vitrification مع ثلاثة آبار مخروطية في صف واحد. إضافة 20 ميكرولترات من محلول التوازن الأول إلى البئر الأولى و 300 ميكرولترات من محلول التبريب إلى الآبار الثانية والثالثة.
لتكبيل مجمعات البويضات الكمولية، أو COCs، استخدم ماصة صغيرة الحجم لنقل مجمع أو أكثر إلى الجزء السفلي من البئر الأول. إضافة ببطء 20 ميكروليترات من محلول التوازن إلى حدود قطرة وانتظر لمدة ثلاث دقائق، ثم إضافة 240 ميكرولترات أخرى من محلول التوازن وانتظر لمدة تسع دقائق. أثناء الانتظار، قم بإعداد صندوق به نيتروجين سائل وصنّف دعم التزجيج مع التجربة أو رمز تعريف القط.
وضع مربع والدعم بالقرب من المجهر ستيريو. بعد اِيَزَلُ COCs، قم بإجراء عملية التزجيج في أقل من 90 ثانية. لvitrify COCs، ملء ماصة صغيرة تتحمل مع محلول التبليس من البئر الثاني.
خذ COCs من أسفل البئر الأول ونقلها إلى سطح البئر الثاني. اغسلي الماصة بمحلول التكبيل، ثم حركي COCs إلى منطقة أخرى من البئر وخلطي الحل المحيط. ملء الماصات مع الحل من منطقة أخرى من البئر.
حرك COCs واخلط الوسط المحيط بها مع الماصات. كرر هذه العملية مرة أخرى. بعد ذلك، قم بغسل الماصات بمحلول التكطيب من البئر الثالث واستخدمه لنقل الـ COCs إلى قاع البئر الثالث.
مرة أخرى، اخلط الحل المحيط. بعد ملء الماصة مع الحل من منطقة أخرى من البئر، نقل COCs وخلط الحل. كرر هذه العملية.
املأ طرف الماصات بمحلول التعبئة من منطقة أخرى من البئر واستخدمها لتحميل COCs على قطاع دعم التزجيج بالقرب من الطرف ، ثم pirate الوسط الزائد. يغرق على الفور دعم الزج في النيتروجين السائل واستخدام المشابك لإغلاقه، والتأكد من أنها لا تزال مغمورة. تخزين الtrification تحميل يدعم في goblet والاحتفاظ بها في خزان النيتروجين السائل تخزين حتى الاحترار.
وضع مرحلة التدفئة على مقربة من المجهر ستيريو وتشغيله إلى 38 درجة مئوية. ادفأ غطاء طبق بيتري على قمة المسرح، ثم انقل دعامات التزجيج من خزان التخزين إلى صندوق مع النيتروجين السائل. إعداد صف واحد من لوحة Repro لكل دعم التهيئة ليتم تسخينها.
إضافة 300 ميكرولترات من محلول التخفيف إلى البئر الأولى و 300 ميكرولترات من محلول الغسيل إلى الآبار الثانية والثالثة. خذ محلول الذوبان من الحاضنة وأسقط 100 ميكروليتر على غطاء طبق بيتري. استخدم المشابك لفتح دعم التزجيج داخل النيتروجين السائل.
ضع غطاء طبق بيتري تحت المجهر الاستريو، ثم التقط بسرعة دعم التزجيج واغمر شريطه في القطرة، وتحريكه حتى تنفصل جميع الأطباق. إزالة الدعم من قطرة بمجرد أن يكون فارغا، ولكن ترك COCs في حل ذوبان لمدة دقيقة واحدة. ملء ماصة مع محلول التخفيف واستخدامه لنقل COCs من انخفاض محلول الذوبان إلى أسفل البئر الأول مع محلول التخفيف.
اترك الـ(كول) هناك لمدة ثلاث دقائق اغسل الماصة بمحلول الغسيل من البئر الثاني، ثم خذ الـ COCs واحركها إلى أسفل البئر الثاني. انتظر خمس دقائق
اغسل الماصة بمحلول من البئر الثالث واستخدمه لنقل الـ COCs من البئر الثاني إلى سطح البئر الثالث. انتظر COCs للمس الجزء السفلي من البئر الثالث. ثم كرر العملية مع منطقة أخرى بئر.
عند الانتهاء، اغسل الماصة مع الثقافة المتوسطة ونقل البويضات إلى طبق الثقافة. الغالبية العظمى من الأماخن البقاء على قيد الحياة بعد البويضات الزج والاحترار وفقا لهذا البروتوكول. تظهر هنا صورة تمثيلية لمجمع بويضات قطة دافئة قابلة للتطبيق ذات جودة مُحمّلة مُضاءة مُلطخة بـ الفلوريسين دياسيتات وروبودييوم يوديد.
ويبين هذا الجدول النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد التزجيج، الذي يصور بيانات ما بعد الاحترار من البويضات المعدة للنضج في المختبر. من أصل 435 بويضة، نجا 395، وسجل إجمالي 90.8٪ من قابلية البقاء بعد الاحترار. ومع ذلك، يمكن ملاحظة بعض التغيرات المورفولوجية بعد الاحترار.
التشوهات المورفولوجية الأكثر شيوعا هي التغيرات في شكل أوبلاسم والحبيبة، وفقدان جزئي أو في بعض الأحيان الكلي من الخلايا الركامية، وكسور زونا pellucida. عند محاولة هذا الإجراء، تذكر أن تعد وسائل الإعلام مقدما بحيث تكون درجة الحرارة المناسبة قبل الاستخدام، ومتابعة درجات حرارة البروتوكول والتوقيت لتجنب سمية الخلية. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على البويضات من الأنواع الأخرى.
وإذا نجح ذلك، يمكن أن يسهم أيضا في المصارف البلازمية الجرثومية من أجل الحفاظ على التنوع البيولوجي في القطط المهددة بالانقراض.
