تسهل هذه التقنية تصور لقاءات تقريب الحمض النووي الموسومة بالمستضد ويمكن تمديدها لتشمل تفاعلات أي بروتين مع بنية الحمض النووي أو آفة قابلة للكشف المناعي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم ترددات التفاعل داخل الخلايا الفردية ، وليس عبر السكان ، وتسمح بتصور التفاعلات المعتمدة على دورة الخلية في الموقع دون إتلاف الخلايا. سيوضح الإجراء إيشاني ماجومدار ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر سيدمان.
في اليوم السابق للتجربة ، قم بالبذور 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة في ملليلتر من الوسط على أطباق استزراع قاع زجاجي 35 ملم معالجة مسبقا بمحلول لاصق خلوي. في اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية في كل طبق ب 37 درجة مئوية خمسة ميكرومولار Dig TMP مكملة بالوسط إلى 50 إلى 70٪ من مزارع الخلايا المتقاربة وأعد الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة للسماح ل Dig TMP بالتوازن. أثناء احتضان الخلايا ، قم بتسخين صندوق الأشعة فوق البنفسجية إلى 37 درجة مئوية.
في نهاية التوازن، انقل الألواح إلى الصندوق الذي تم تسخينه مسبقا لتعريض الخلايا لجرعة ضوء UVA لمدة خمس دقائق تبلغ ثلاث جول لكل سنتيمتر مربع واستبدل المواد الطافية بملليلتر من وسط الاستزراع الطازج الذي تم تسخينه مسبقا قبل إعادة الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، اغسل الثقافات برفق باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بإصلاح الخلايا بمليلتر واحد من 0.1٪ فورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني قبل معالجة الخلايا مرتين ب 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الهيكل الخلوي المكمل ب RNase لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل علاج لإزالة السيتوبلازم.
بعد الحضانة الثانية ، اغسل الخلايا بمليلتر من PBS ثلاث مرات قبل تثبيت الخلايا بمليلتر واحد من 4٪ فورمالديهايد في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت الثاني ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني كما هو موضح ، متبوعا بالعلاج بملليلتر واحد من الميثانول البارد 100٪ لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في ملليلتر من PBS ، تليها حضانة لمدة 10 دقائق في 80 ميكرولتر من خمسة ملليمولار Triton X-100 عند أربع درجات مئوية.
في نهاية الحضانة ، عالج الخلايا ب 100 ميكرولتر من خمسة ملليمولار EDTA في PBS ، مع استكمال ميكرولتر واحد من 100 ملليغرام لكل ملليلتر من RNase A لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني قبل تخزينها في 5٪ من ألبومين مصل الأبقار و 10٪ مصل حمار في برنامج تلفزيوني في غرفة رطبة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. لإجراء فحص ربط القرب ، أضف 40 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأساسي الذي يهم مركز كل لوحة واحتضان الألواح في الغرفة الرطبة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بمليلتر من PBST قبل إضافة 40 ميكرولترا من محلول مسبار PLA الطازج لكل طبق لمدة ساعة واحدة في حاضنة زراعة الخلايا. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في ملليلتر من المخزن المؤقت A على منصة مائلة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير ، أضف 40 ميكرولترا من مزيج الربط الطازج إلى كل طبق للحصول على حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، تليها ثلاث غسلات لمدة دقيقتين في المخزن المؤقت A على منصة الإمالة.
بعد الغسيل الأخير ، أضف 40 ميكرولترا من محلول التضخيم الطازج إلى كل لوحة لحضانة لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ست مرات باستخدام مخزن مؤقت جديد B لمدة 10 دقائق لكل غسلة على منصة الإمالة. بعد غسل المخزن المؤقت الأخير B ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 0.01x buffer B لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل وضع العلامات بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة في الغرفة الرطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، اغسل العينات بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق على منصة مائلة في PBST في درجة حرارة الغرفة قبل تركيبها في وسط تركيب مكمل ب DAPI. في غضون أربعة أيام من التركيب ، قم بتصوير ما لا يقل عن 100 ملاحظة لكل عينة أو خلايا حالة على مجهر فوق فلوري أو مجهر متحد البؤر ، باستخدام نفس إعدادات التعرض لكل من العينات التجريبية وعينات التحكم. يمكن تصور علامة الحفر عن طريق التألق المناعي للكشف عن وجود روابط متقاطعة بين الخيوط في جميع أنحاء النواة.
لتصور تفاعل الردود مع الارتباطات المتقاطعة ، يمكن تطبيق PLA لتصور تكرار ارتباط MCM5 وعلامة Dig ، بعد ساعة واحدة من إدخال الارتباط المتقاطع بين الخيوط. نظرا لأن إجهاد النسخ المتماثل ينشط ATR كيناز ، فإن PLA بين pMCM اثنين سيرين 108 وعلامة Dig موجبة أيضا. يمكن تقديم نتائج PLA من النوى الفردية في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد تسمح بتصور لقاءات الارتباطات المتقاطعة المتقاطعة في جميع أنحاء النواة.
يشير تحليل شوكة النسخ المتماثل إلى أن لقاءات الارتباطات المتقاطعة تظهر ظاهرة إعادة تشغيل النسخ المتماثل غير المتوقعة ، حيث تفشل بروتينات مجمع GINS في إظهار إشارة PLA مع الارتباطات المتقاطعة بين الخيوط. في المقابل ، يكون الفحص مع CD 45 إيجابيا ، مما يشير إلى الاحتفاظ ببروتين القفل الآخر. عندما يتم تحضين الخلايا بمثبط ATR ، يتم قمع إعادة التشغيل تماما ويكون GINS Dig PLAs إيجابيا بقوة.
علاج CSK + R ضروري لتقليل إشارة الخلفية. تأكد من طلاء الألواح بمادة لاصقة للخلايا والبادئة بنسبة 0.1٪ FA وإلا ستقشر الخلايا اللوحة.
