وأيد هذا العمل من قبل على منحة المشروع ويلكوم (078043/Z/05/Z) لROJW

PART A: عالي الإنتاجية نمو الثقافات البكتيرية. 1. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 2 مل من متوسطة Autoinduction باستخدام 24 لوحات جيدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sterilise لوحات 24 جيد من قبل الميكروويف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 1.5 مل من المتوسط ​​autoinduction (بين عشية وضحاها اكسبرس متوسطة) مع المستعمرات البكتيرية نمت حديثا أو الجلسرين الأسهم المجمدة. ونحن عادة تطعيم ثلاثة آبار في المستعمرات الفردية متحولة مع 3 المستنسخة. الاحتياطي ستة آبار لعناصر إيجابية وسلبية. لعناصر إيجابية نكبر استنساخ wildtype الثلاثة وللضوابط السلبية نحن في استنساخ بنسبة 2 التي تم تحويلها مع البلازميد غير التعبير عن. تحقق من وجود التعقيم الكافي لوحة من ترك واحدة فارغة تماما لسيطرة المتوسطة فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية وتهتز في 250 دورة في الدقيقة. نستخدم لاك محرض BL21 (DE3) رشيد 2 الخلايا. Autoinduction المتوسطة يحتوي على خليط من الجلوكوز واللاكتوز. البكتيريا في البدايةتتغذى على السكر ومن ثم البدء في استخدام اللاكتوز، والذي يدفع أيضا التعبير عن البروتينات المؤتلف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء ووضع لوحة على منصة الروبوتية. </li></ol> B PART: تنقية البروتينات المؤتلف من الروبوتية. 2. إعداد منهاج الروبوتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل العازلة يغسل ملي تتكون من إيميدازول 20، 0.1٪ تريتون X-100، 0.5 M كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، خلات، ودرجة الحموضة 7.9، 10 ملي MgOAc 2، 0.7 مم ZnOAc 2، الجلسرين 10٪، وشطف العازلة التي تتكون من الاميدازول M 0.5، 0.1٪ تريتون X-100، 0.5 M كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، خلات، ودرجة الحموضة 7.9، 10 ملي MgOAc 2، 0.7 مم ZnOAc 2، الجلسرين 10٪. وسوف تستخدم هذه المخازن المؤقتة لغسل حبات بعد أن تم ملزمة البروتينات الموسومة لهم، أو أزل إلى البروتينات من الخرز، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل مخفف البكتيرية (100 مل ماء مقطر مع 15 ميكرولتر كاشف مضاد الرغوة). وسيتم استخدام هذا الحللجعل التخفيفات الثقافات البكتيرية ليلة وضحاها لكثافة بصرية (A600) القياسات. وجود مضاد الرغوة في مخفف يمنع تشكيل فقاعات الهواء التي من شأنها أن تتداخل مع قارئ لوحة القياسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الحل يتكون من تحلل كاشف FastBreak 10X، 2 ميكرولتر لكل عينة lysonase و15 مم MgOAc 2. FastBreak يحتوي على مزيج من المنظفات والأملاح التي كسر جدران الخلايا البكتيرية وتسهيل الإفراج عن البروتينات داخل الخلايا. Lysonase هي مزيج من الملكية والليزوزيم نوكلياز أ. الليزوزيم يساعد في تعطيل جدار الخلية ويساعد على هضم نوكلياز صدر الأحماض النووية البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: مستحضرات لمدة 6 هيدروكلوريد الجوانيدين M الحل. بعض البروتينات المؤتلف تميل إلى التمسك الإبر تفلون المغلفة pipetting. الحل هيدروكلوريد الجوانيدين يبدل طبيعة البروتينات ويغسل لهم قبالة على نحو أكثر فعالية من الماء الذي يستخدم بشكل روتيني لشطف قابل للغسل الروبوتية نصائح pipetting بعد كل شارعالجيش الشعبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكميات BCA البروتين (حمض bicinchoninic) كاشف عن طريق خلط محلول حمض bicinchoninic (كاشف A) والحل كبريتات النحاس (كاشف B): السندات الببتيد النحاس 2 + تقليل من العنصر 4 كبريتات النحاس الموجودة في الكاشف BCA إلى النحاس حيث 1 + كمية النحاس 1 + يتناسب مع عدد من السندات الببتيد موجودة في الحل. في الخطوة الثانية، اثنين من جزيئات حمض bicinchoninic كلاب النحاس 1 + مما أدى إلى تحول الامتصاصية نانومتر إلى 562، مما أدى إلى اللون الأرجواني. رد الفعل هو اللون المعتمدة على الزمن ويحتاج عادة إلى عدة ساعات تكون نهائية. بعد أن لون ثابت لمدة عدة ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أحواض أو لوحات من الحجم الصحيح ووضعها في مواضعها المخصصة مسبقا على منصة الروبوتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد 24 لوحة جيدا للنفايات هيدروكلوريد الجوانيدين، واثنين من لوحات واضحة بشكل جيد ل96-OD 600 و قياسات الامتصاصية واحدة زرقاء 96-جيدا لوحة اله تنقية البروتينات على مواقعهم على المنصة. مكان واحد 96-deepwell لوحة على الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع MagneHis ني جزيئات البروتينات التي تربط عن طريق تشكيل يخلب به مع صاحب-5-بهم أضعاف في الماء المقطر وملئها في وحدة حبة التحريك. تبديل النمام على الحفاظ على حبات في التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على منصة الروبوتية ومسح الإبر pipetting لعدة دقائق لإزالة فقاعات الهواء التي قد تعترض مع دقة pipetting. يتم مسح الإبر pipetting إعادة استخدامها في الخطوات بين pipetting الفردية. وبدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم نصائح التخلص منها. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة من آليا. بروتوكول الروبوتية عند الطلب. </li></ol> 3. يتم فحص نمو الخلايا عن طريق قياس OD600 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تخفيف 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 90 ميكرولتر من محلول مخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 إلى التأكد من أن البكتيريا قد نمت لكثافة مماثلة(الشكل 1). </li></ol> 4. يتم تقسيم الخلايا حتى حرر البروتينات والسماح لحبة ملزم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتوزيع 100 ميكرولتر من التعليق المغناطيسي ني حبة في كل بئر من لوحة جيدا 24 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل 900 ميكرولتر من كل ثقافة على نطاق صغير في لوحة البكتيرية 24 جيد يحتوي على الخرز. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج FastBreak / lysonase 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل 24 لوحة جيدا إلى منصة تهتز لزعزعة السريع (800 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تتعطل جدران الخلايا البكتيرية من خلال مزيج من القوات الميكانيكية والكيميائية والعمل يتم الإفراج عن البروتينات المنتجة recombinantly إلى الحل. مع تقارب به على الفور أنها تربط حبات النيكل ممغطس مخلبية. </li></ol> 5. تغسل حبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل الخلايا التي تحتوي على الخرز لست] معلق المغناطيسي لوحة 96-deepwell التي يتم وضع على حامل مع مagnetic قضبان تلك الشريحة بين الآبار. لوحات 96-جيدا قد حصلت على مربع مخروطية الشكل السفلي والذي يسمح أسهل إزالة طاف. يمكن للآبار عقد كميات تصل إلى 2.1 مل ولكن تمتلئ أحجام أصغر بكثير. هذا يمكننا من أداء قوي يهز الخطوات دون عينة عبر تلوث الرش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل نصائح ماصة بين الفرد الخطوات pipetting مع 6 M الجوانيدين، حمض الهيدروكلوريك. هذه الخطوة هو أمر حاسم لتنقية TFIIB و &quot;مثبت&quot; البروتينات الأخرى لتجنب انتقال التلوث. مع بروتينات أخرى قد تكون كافية لشطف بالماء على نطاق واسع الإبر بين الخطوات pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قضبان المغناطيسي للموقف المغناطيسي جذب الخرز ممغطس، وسحب بها بعيدا عن مراكز الآبار والسماح للالإبر pipetting حرية الوصول إلى طاف. يتم تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف 500 الأولى ميكرولتر من العازلة غسل لوحة 24 جيدا ونقل فيما بعد إلى لوحة 96-جيدا لهnsure نقل كامل من الخرز. تتم إزالة لوحة 24 أيضا من شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف آخر ميكرولتر 500 من العازلة يغسل مباشرة إلى اللوحة 96-حسنا، يتم نقل لوحة إلى شاكر واهتزت بقوة لمدة 1 دقيقة. تم نقل لوحة إلى موقف المغناطيسي وتجاهل العازلة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتكرر هذه الخطوة مرتين وانتهاء الإجراء عن طريق إزالة أي غسل بقايا من لوحة العازلة. </li></ol> 6. أزل البروتينات في الاحتياطي شطف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة للشطف الخرز، ويتم نقل لوحة إلى شاكر واهتزت بقوة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم نقل لوحة إلى شاكر وشطافة، والتي تحتوي على البروتين المنقى المؤتلف، يتم نقلها إلى لوحة جديدة. </li></ol> 7. قياس تركيزات البروتينات تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل 190 ميكرولتر من مزيج كاشف BCA إلى لوحة 96-جيدا واضحة و10 ميكرولتر من برووأضاف TEIN الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عدة ساعات من الحضانة (5-6 عادة أو بين عشية وضحاها)، وقياس الامتصاصية وذلك لمقارنة المعايير BSA لتحديد تركيزات كل من البروتين النقي التحضيرات (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن لتنقية البروتينات يمكن استخدامها لتطبيقات المصب في تركيزات المناسب (الشكل 3). </li></ol> 8. ممثل النتائج بروتوكول تنقية يقدم مرحلتين مراقبة الجودة، والأمثلة التي تظهر. ونحن قادرون على تحديد وتوثيق المشاكل المحتملة في مرحلة نمو البكتيريا (الشكل 1) في وقت لاحق وعلى تقييم عوائد من البروتينات المطهرون (الشكل 2). نحن تنقية البروتينات عادة واختبارها في ثلاث نسخ. هذا، جنبا الى جنب مع الخطوات مراقبة الجودة اثنين، يعطينا الثقة في أن أي تغيير لاحظنا في المقايسات الفنية لدينا هي نتيجة لphenotyp متحولةه (الشكل 3) وليس بسبب الاختلافات التجريبية أو التنقيات الفاشلة. الحصول على عوائد تتراوح عادة 50 حتي 200 ميكروغرام وأكثر من كافية لفحوصات الفنية المختلفة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> الشكل 1. الرسم البياني القياسات OD من 24 لوحة جيدا مع الثقافات بين عشية وضحاها. قد نمت الحيوانات المستنسخة ثلاثة من المتغيرات 6 متحولة TFIIB وكذلك من TFIIB wildtype. استنساخ اثنين من يحمل البلازميد غير التعبير عن وبئر مع المتوسط ​​إلا أن تكون بمثابة الضوابط السلبية. القياسات OD تبين أن هناك اختلافات صغيرة في معدلات النمو بين الثقافات الفردية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> الشكل 2. غلة البروتين الحصول عليها من هذه الثقافات على النحو الذي يحدده الفحص BCA وأكدته PAGE SDS. لا يتم التعبير عن واحدة من المتغيرات عند مستويات مرتفعة. كوم فيbination مع الشكل 1، يمكننا أن نستنتج أن هذا لم يكن بسبب نمو الخلايا الفرق ولكن نظرا لعدم التعبير البروتين الناجم بشكل صحيح. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> الشكل 3. نتيجة ممثلا لفحص النسخ. قمنا بقياس نشاط التحفيز من المتغيرات TFIIB على إنتاج النصوص فاشلة صغيرة من RNAP. هنا، تظهر آثار تحفيز مكتبة كاملة من الأحماض الأمينية واحد من بدائل بقايا TFIIB K87. وأكد على درجة عالية من تكرار الخطأ بنسب صغيرة. ويصور A جل عينة تبين أداء ثلاث طفرات بالمقارنة مع الضوابط wildtype، (WT) السلبية (NC) وشطف العازلة لا يسيطر سوى على تحتها.

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center.">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وتنقية البروتين المؤتلف الآلي الطريقة الموضحة هنا يسمح للإنتاج وتنقية لعدد كبير من البروتينات الطافرة في شكل صغير الحجم للغاية في ظل ظروف استنساخه مع الحد الأدنى من التدخل البشري. الشكلان 1 و 2 من النتائج عرض منهجية ضوابط الجودة وأمثلة من تنقية البروتينات. الشكل 3 يبين أن عوامل النسخ تنقية المستخدمة في هذا المثال تنفيذ استنساخه بطريقة غاية في المقايسات الفنية. على الرغم من وضعت إجراءات لتنقية TFIIB archaeal، فإنه ينطبق على نطاق واسع لتنقية البروتينات تقارب الموسومة. فإن استخدام مثل هذه البروتوكولات تنقية الآلي مما يسهل كثيرا من التحليل الكيميائية الحيوية للبروتينات المؤتلف وسيعزز بالتالي من فهمنا للبروتين البروتين التفاعلات على نطاق ويصعب تحقيق يدويا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> بين عشية وضحاها اكسبرس متوسطة TB الفوري </td><td> ميرك كيماويات المحدودة </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> FastBreak </td><td> Promega المحدودة </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase الكاشف التجهيز البيولوجي / 1 مل </td><td> ميرك كيماويات المحدودة </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> مضاد الرغوة 204 </td><td> سيغما الدريخ المحدودة </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis ني الجسيمات </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> إيميدازول </td><td> سيغما الدريخ المحدودة </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma قاعدة </td><td> سيغما الدريخ شركاتأي المحدودة </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninic تقرير حمض البروتين </td><td> سيغما الدريخ المحدودة </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> بئر عميقة لوحة 2،2 مل ساحة ويلز PP pk10 </td><td> Anachem المحدودة </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية MicroWell 96 البوليسترين مسطحة القاع جيدا لم يعالج 12 كم من لوحات واضحة 5 0.4 مم 128 مل حجم 86 ملم X جيدا الحرارية العلمية نونك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية الأزرق </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24-RB حسنا كتل (24) </td><td> QIAGEN </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> الجوانيدين هيدروكلوريد </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> قابل للغسل إبرة لTheOnyx </td><td> Aviso شركة محدودة </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> الرف كاشف لالخرز المغناطيسي </td><td> Aviso شركة محدودة </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> لوحة قارئ التآزر HT </td><td> بيوتيك </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> الروبوتية منهاج TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso شركة محدودة </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية شاكر Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-A جيدا نوع المغناطيس </td><td> QIAGEN </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

البلورات بالأشعة السينية هو الطريقة المفضلة للحصول على عرض تفصيلي لبنية البروتينات. مثل هذه الدراسات تحتاج إلى أن تستكمل التحليلات الكيميائية الحيوية للحصول على مزيد من الأفكار التفصيلية في هيكل / وظيفة العلاقات. التقدم في تكنولوجيا توليف الجينات وقليل النوكليوتيد جعل استراتيجيات الطفرات واسعة النطاق من الممكن أكثر فأكثر، بما في ذلك استبدال بقايا الهدف من جميع الأحماض الأمينية الأخرى 19. مكسب أو خسارة، من بين الظواهر الدالة تسمح ثم لابد من استخلاص استنتاجات منهجية، مثل مساهمة خاصة لمخلفات النشاط التحفيزي الاستقرار البروتين، و / أو البروتين البروتين خصوصية التفاعل. من أجل أن تنسب الظواهر المختلفة لطبيعة الطفرة - بدلا من تقلب الظروف التجريبية - من المهم جدا لتنقية وتحليل البروتينات بطريقة يمكن التحكم بها وقابلة للتكرار. عالية الإنتاجية واستراتيجيات أتمتة البروتوكولات دليل علىخلقت الروبوتية معالجة السائل منصات الفرص لتنفيذ هذه الإجراءات المعقدة الجزيئية البيولوجية مع تدخل بشري قليلا ومعدلات الخطأ الحد الأدنى من 1-5. هنا، نقدم طريقة عامة لتنقية البروتينات المؤتلف صاحب الموسومة بطريقة عالية الإنتاجية. في دراسة حديثة، طبقنا هذا الأسلوب لتحقيق هيكل الوظائف مفصلة من TFIIB، وهو مكون من آلات النسخ القاعدية. أمر لا غنى عنه لTFIIB النسخ المروج-الموجهة في المختبر، كما أنها ضرورية لتوظيف بوليميراز RNA إلى مجمع preinitiation 6-8. TFIIB يحتوي على رابط مجال المرنة التي تخترق موقع نشط شق من بوليميريز RNA 9-11. يمنح هذا المجال رابط نشاطين قابلة للقياس الكمي كيميائيا على TFIIB، أي (أنا) وتحفيز للنشاط الحفاز خلال المرحلة &#39;فاشلة&#39; من بدء النص، و (الثاني) مساهمة إضافية إلىمحددة بوليميريز RNA توظيف في preinitiation معقدة 4،5،12. نحن استغلال طريقة تنقية عالية الإنتاجية لتوليد واحدة، استبدال مزدوجة وثلاثية والحذف الطفرات داخل رابط TFIIB وتحليل في وقت لاحق لهم في المقايسات الفنية للتأثير على تحفيز النشاط التحفيزي للبوليميراز RNA 4. تماما، ونحن ولدت، وتنقية وتحليل طفرات 381 - وهي مهمة كان يمكن أن يكون وقتا طويلا وشاقة لأداء يدويا. أنتجنا ويعاير البروتينات في multiplicates التي سمحت لنا أن نقدر أي اختلافات التجريبية وقدم لنا فكرة واضحة عن تكرار نتائجنا. هذه الطريقة بمثابة بروتوكول عام لتنقية البروتينات، وصاحب الموسومة وقد استخدم بنجاح لتنقية البروتينات المؤتلف أخرى. هو الأمثل حاليا هو لتنقية البروتينات من 24 ولكن يمكن تكييفها لتنقية البروتينات تصل إلى 96.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins at JoVE.com

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

وصفنا طريقة لتنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف باستخدام السائل التعامل مع الروبوتات. هذه الطريقة تنطبق بصورة عامة على تنقية الصغيرة من البروتينات القابلة للذوبان صاحب الموسومة في شكل عالية الإنتاجية.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  Imperial College London. وصفنا طريقة لتنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف باستخدام السائل التعامل مع الروبوتات. هذه الطريقة تنطبق بصورة عامة على تنقية الصغيرة من البروتينات القابلة للذوبان صاحب الموسومة في شكل عالية الإنتاجية.

Video: High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...