يوضح البروتوكول طريقة سريعة لتحديد البروتينات البكتيرية باستخدام تحريض المضادات الحيوية وقياس الطيف الكتلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السرعة والبساطة. إعداد العينة غير معقد.
يمكن توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل توصيف أي بكتيريا مسببة للأمراض ، مثل عوامل الفوعة أو مقاومة المضادات الحيوية لإعلام العلاج المناسب بشكل أفضل للعدوى البكتيرية. للبدء، استخدم حلقة ميكرولتر واحدة معقمة لحصاد البكتيريا من مستعمرات واحدة تزرع على لوحة أغار LB. ونقل إلى اثنين من ملليلتر O-حلقة خط حلقة المسمار غطاء أنبوب الطرد الدقيق التي تحتوي على 300 ميكرولتر من المياه HPLC الصف.
ثم دوامة لفترة وجيزة الأنبوب والكريهات الخلايا عن طريق الطرد المركزي، في المياه بقايا 0.75 ميكرولتر من عينة supernatant على الهدف MALDI الفولاذ المقاوم للصدأ، والسماح لها بالجفاف. تراكب بقعة عينة المجففة مع 0.75 ميكرولتر من محلول مشبع من حمض السنابينيك أعدت في 33٪ أسيتونيتريل، 67٪، و 0.2٪ حمض ثلاثي فلوريك، والسماح بقعة لتجف. بمجرد تجفيف البقعة، قم بتحميل الهدف في مطياف الكتلة.
افتح برنامج الاستحواذ وانقر فوق اكتساب الوضع الخطي MS أو نطاق الكتلة للشحن والكتلة للشحن من الحدود السفلية والعليا إلى حقولها الخاصة. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على قالب الهدف MALDI. ثم قم باكتئاب زر الماوس الأيسر، واسحب المؤشر فوق عينة الموقع لتحديد المنطقة المستطيلة التي سيتم أخذ عينات منها لإجراء عملية استئصال ليزر أو تأين.
حرر زر الماوس لبدء عملية الاستحواذ وجمع 1000 طلقة ليزر لكل بقعة عينة. إذا لم يتم الكشف عن الأيونات زيادة كثافة الليزر عن طريق ضبط شريط مقياس انزلاق تحت كثافة الليزر حتى يتم الكشف عن إشارة أيون البروتين. بعد الانتهاء من اكتساب الوضع الخطي MS، انقر فوق اكتساب وضع انعكاس MS/MS.
أدخل كتلة السلائف ليتم تحليلها في حقل كتلة السلائف. بعد ذلك ، أدخل عرض العزلة في دالتون في نافذة كتلة السلائف للجانب الكتلي المنخفض والعالي من كتلة السلائف. انقر فوق الزر إيقاف CID.
ثم انقر فوق الزر "مثبط ميتاستابل على". ضبط كثافة الليزر إلى ما لا يقل عن 90٪ من القيمة القصوى عن طريق ضبط شريط مقياس انزلاق كما هو موضح. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على القالب الهدف MALDI، ثم الاكتئاب زر الماوس الأيسر، واسحب المؤشر فوق بقعة عينة لتحديد المنطقة مستطيلة لأخذ عينات من أجل الاستئصال بالليزر أو التأين، والإفراج عن زر الماوس لبدء الاستحواذ وجمع 10،000 طلقات الليزر لكل بقعة عينة كما هو موضح.
انقر نقرا مزدوجا فوق ملف "الباحث عن القابل للتنفيذ" للبروتين، وستظهر نافذة واجهة المستخدم الرسومية. أدخل كتلة العلامات الحيوية للبروتين في حقل كتلة البروتين الناضجة، وخطأ قياس الكتلة في مجال التسامح الجماعي. اختياريا، انقر على زر حاسبة كتلة البروتين b/y أيون مجاني لحساب كتلة البروتين من زوج أيون جزء مجاني المفترضة، وسوف تظهر النافذة المنبثقة من أداة حاسبة كتلة البروتين.
أدخل نسبة الكتلة إلى الشحن لزوج أيون الشظايا المجاني المفترض، وانقر على زر إضافة زوج، وستظهر كتلة البروتين الحاسبة. نسخ لصق هذه القيمة في حقل الكتلة البروتين ناضجة، وإغلاق نافذة أداة حاسبة كتلة البروتين. انقر على المربع تعيين قيود المخلفات.
حدد طول الببتيد إشارة المحطة الطرفية نهاية، والنافذة المنبثقة مع مقياس انزلاق والمؤشر سوف تظهر وتحريك المؤشر إلى طول الببتيد إشارة المطلوبة. إذا لم يتم تحديد طول الببتيد إشارة، سيتم إجراء اقتطاع تسلسل غير مقيد من قبل البرنامج. ضمن شرط أيون جزء، حدد بقايا لانشقاق العمود الفقري Polypeptide عن طريق النقر على مربعات واحد أو أكثر من المخلفات، D-E-N، و / أو P.ثم انقر على إدخال أيونات جزء زائد واحد ليكون زر البحث، وسوف تظهر صفحة جزء المنبثقة.
انقر فوق الزر إضافة جزء أيون التالي، وسيظهر حقل منسدل لكل أيون جزء ليتم إدخاله. أدخل الكتلة حسب نسب الشحنة من أيونات الشظايا والكتلة المرتبطة بها عن طريق تحمل الشحنة. ثم انقر على زر حفظ وإغلاق.
في المربع الجانبي الأيمن من عدد أيونات الأجزاء التي تحتاج إلى مطابقة ، مرر لتحديد الحد الأدنى لعدد أيونات الأجزاء التي يجب مطابقتها لتحديد الهوية ، وحدد بقايا السيستين في حالتها المؤأكسدة. إذا لم يتم التعرف على البروتينات بعد البحث، كرر البحث مع السيستين في حالتها المخفضة. ضمن إعداد الملف، انقر فوق رمز ملف FASTA حدد لاستعراض وتحديد ملف FASTA يحتوي على تسلسل البروتين في سيليكو من سلالة البكتيرية التي شيدت سابقا.
ثم حدد مجلد إخراج ثم قم بإنشاء اسم ملف إخراج. انقر فوق رمز تشغيل البحث على إدخالات الملفات. ستظهر نافذة منبثقة بعنوان تأكيد معلمات البحث التي تعرض معلمات البحث قبل بدء البحث.
وإذا كانت معلمات البحث صحيحة، فانقر فوق بدء البحث. إذا كانت المعلمات غير صحيحة، انقر فوق إلغاء الأمر ثم إعادة إدخال المعلمات الصحيحة. بمجرد بدء البحث، سيتم إغلاق إطار المعلمة وستظهر نافذة منبثقة جديدة مع شريط تقدم، تظهر تقدم البحث وعدد الهويات التي تم العثور عليها.
عند الانتهاء من البحث، سيتم إغلاق شريط التقدم تلقائيا، وسيتم عرض ملخص للبحث في حقل السجل من واجهة المستخدم الرسومية جنبا إلى جنب مع نافذة منبثقة جديدة تعرض التعرف على البروتين وجدت. في الدراسة الحالية، نمت الثقافات البكتيرية في LB مع تركيزين مختلفين من الوميتوسين-C. الطيف الكتلي للثقافة البكتيرية نمت مع تركيز الوميتوسين-C.
تم تحديد بروتين الصدمة الباردة C وبروتين الصدمة الباردة E وبروتين محمول على البلازميد غير معروف الوظيفة. تم تحليل أيون البروتين غير معروف في 9780 من قبل MS / MS، وتم عزل أيون السلائف مع نافذة محدد أيون الوقت من حوالي 100 دالتون. أيون جزء في كتلة لشحن 9675.9 هو امتداد من تفكك أيون البروتين ميتاستابل في 9655.
تسلسل بروتين المناعة للكولايسين E3 يحتوي على بقايا أساسية المواقع المحتملة من التأين. أيونات الشظايا التي تم اكتشافها من شق العمود الفقري للبوليبتيد ، عندما تم استخدام الشكل المخفض من السيستين أثناء البحث. تتم إزالة ميثيونين N-المحطة كتعديلات الترجمة آخر.
عندما نمت الثقافة البكتيرية بتركيز كبير من الميوميسين-C ، تم تحديد بروتين المناعة للبكتيريا. تم تحليل الذروة غير المعروفة في 9651 من قبل MS / MS ، وتم عزل أيون السلائف مع نافذة TIS أضيق وغير متماثلة من ناقص 75 زائد 60 دالتون. تسلسل بروتين المناعة من البكتيريا يحتوي على المخلفات الأساسية المواقع المحتملة من التأين.
أيونات الشظايا التي تم اكتشافها من شق العمود الفقري للبوليبتيد ، عندما تم استخدام الشكل المخفض من السيستين أثناء البحث. مع تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية، قد تختلف وفرة البروتين النسبي. وتم تحليل هذه باستخدام قياس الطيف الكتلي.
عند حصاد الخلايا البكتيرية، لاحظ مورفولوجيا المستعمرة والنمو البكتيري فيما يتعلق بالمضادات الحيوية والتركيز. حلقة ميكرولتر واحدة من الخلايا ضرورية للكشف عن البروتينات.
