يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام تقنية مشبك التصحيح لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا عن طريق قياس تسرب بروتون الميتوكوندريا مباشرة عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي. يساعد القياس المباشر لتيار البروتون من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلي على تحديد وتوصيف الآليات الجزيئية المسؤولة عن توليد الحرارة الميتوكوندريا بدقة. لا تسمح هذه التقنية فقط بقياس تيار البروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، ولكن أيضا لدراسة الموصلات الأخرى المهمة لوظيفة الميتوكوندريا ، مثل الكالسيوم أو المستقلبات مثل نيوكليوتيدات الأدينين.
ضع الفأر الرحيم على ظهره ورش الكحول لتنظيف الشعر وتبليله. ثم ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين على الصدر. بعد الإمساك بالجلد باستخدام ملاقط ، قم بتشريح القلب من صدر الحيوان وشطفه لإزالة كل الدم إلى كوب 10 ملليلتر مع خمسة ملليلترات من محلول العزل البارد.
بمجرد تطهير القلب من آثار الدم ، انقله إلى كوب آخر سعة 10 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من عازل العزل البارد وقم بتقطيعه إلى قطع رقيقة. ثم انقله إلى مجانس زجاجي مبرد بالجليد سعة 10 ملليلتر. استخدم أداة تحريك علوية لتجانس الأنسجة المقطوعة مسبقا على الجليد بست ضربات لطيفة بسرعة يتم التحكم فيها تبلغ 275 دورة في الدقيقة.
انقل المتجانس إلى أنبوب مخروطي بارد جليدي سعة 15 ملليلتر وقم بطرده مركزيا بسرعة 700 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتكسير النوى والخلايا غير المنقطعة. جمع supernatant في أنبوب جديد 15 ملليلتر ووضعه على الجليد. قم بطرد مركزي للغاز الفائق بسرعة 8،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على حبيبة تحتوي على الميتوكوندريا.
أعد تعليق حبيبة الميتوكوندريا في 3.8 ملليلتر من المانيتول العازل مفرط التوتر البارد واحتضن تعليق الميتوكوندريا على الجليد لمدة 10 إلى 15 دقيقة. املأ تعليق مانيتول الميتوكوندريا المفرط التوتر في خلية ضغط صغيرة مبردة من الصحافة الفرنسية. ثم ضع الزنزانة على الصحافة الفرنسية.
بعد ذلك ، حدد الوضع المنخفض للضغط الفرنسي وضغط التعليق من خلال خلية الضغط الصغيرة عند 110 على القرص للميتوكوندريا ذات الدهون البنية ، وعند 140 للميتوكوندريا القلبية ، مما يضمن خروج التعليق من خلية الضغط الصغيرة بمعدل قطرة واحدة في الثانية. اجمع القطرات في أنبوب مخروطي مبرد بالثلج سعة 15 ملليلتر. الطرد المركزي التعليق في 10،500 مرات G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق حبيبات mitoplasts في 0.5 إلى 2 ملليلتر من العازلة لكلوريد البوتاسيوم مفرط التوتر المثلج وتخزين التعليق على الجليد. اسحب خيوط زجاج البورسليكات في يوم التسجيل باستخدام مجتذب ماصة دقيقة ، ووضع برنامج على المجتذب المستخدم لتوليد الماصات بدرجة عالية من القابلية للتكرار. أدخل خيطا زجاجيا واحدا داخل المجتذب واسحبه للحصول على ماصتين متطابقتين تقريبا من خيوط البورسليكات الواحدة.
اضبط البرنامج عندما تصبح الماصات غير متناسقة بين دورات السحب بسبب شيخوخة خيوط صندوق التسخين الخاصة بالمسحوب. ضع الماصة داخل ملمع الماصة وضع الطرف بالقرب من الخيوط تحت تكبير 100X لإطلاق النار تلميعها. اضغط على دواسة القدم عدة مرات لتسخين الخيوط دون انسداد أو إتلاف منحنى الطرف.
البولندية حتى الماصات لديها مقاومة بين 25 و 35 ميجا أوم يتم الحصول عليها عند ملئها بمحلول ماصة قائم على TMA. ينزلق غطاء ما قبل الحضانة بنسبة 0.1٪ من الجيلاتين لتقليل التصاق mitoplast وشطفه بمحلول حمام كلوريد البوتاسيوم قبل إيداع تعليق mitoplast. قم بإعداد تخفيف خام عن طريق خلط ما يقرب من 35 ميكرولتر من تعليق mitoplast المركز مع 500 ميكرولتر من محلول حمام كلوريد البوتاسيوم ووضعه على زلات الغطاء الموضوعة مسبقا في بئر من صفيحة من أربعة آبار.
احتضن على الثلج لمدة 15 إلى 20 دقيقة حتى تنزل الكتل الارتسابية أسفل الغطاء . املأ غرفة الحمام بالكامل بحوالي 50 ميكرولتر من محلول حمام كلوريد البوتاسيوم وانقل زلة غطاء مع mitoplasts داخل الغرفة باستخدام ملاقط تشريح دقيقة رقيقة مع طرف عازم. رتب انزلاق الغطاء في الجزء السفلي من الغرفة دون اختراق الغرفة للحفاظ على استقرار mitoplasts على زلة الغطاء.
اختر mitoplast غير لاصق فردي عن طريق مسح انزلاق الغطاء تحت المجهر بهدف 60X. قم بتحميل الماصة بمحلول الماصة وضعها في حامل الماصة. أحضر الماصة إلى محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق وحركها فوق mitoplast المحدد مباشرة للاقتراب من IMM.
امسك جهد الغشاء عند صفر مللي فولت وطبق نبضات 10 مللي فولت باستخدام أمر اختبار الغشاء في برنامج مكبر الصوت. قم بتطبيق ضغط سلبي طفيف لإنشاء جيجاسيال بسرعة باستخدام IMM. ارفع الماصة مع تثبيت mitoplast لإبعادها عن انزلاق الغطاء لتجنب كسر الختم بسبب انحراف الماصة أثناء التجربة.
قم بتعويض السعة الضالة العابرة بأمر اختبار الغشاء في برنامج مكبر الصوت قبل اختبار تكوين mitoplast الكامل للحصول على قياس السعة الصحيح لغشاء mitoplast بعد الاقتحام. قم بتطبيق نبضات الجهد قصيرة المدة مع برنامج مكبر الصوت لتمزيق رقعة الغشاء تحت ماصة الزجاج وتحقيق تكوين mitoplast الكامل. بعد الاقتحام ، قم بتركيب السعة العابرة مع خيار اختبار الغشاء لبرنامج مكبر الصوت لتقييم سعة الغشاء ومقاومة الوصول إليه.
مباشرة بعد الاقتحام ، استبدل محلول حمام كلوريد البوتاسيوم بمحلول حمام HEPES عن طريق التروية. قم بتطبيق بروتوكول منحدر 850 مللي ثانية باستخدام برنامج مكبر الصوت. يؤدي تطبيق بروتوكول منحدر الجهد إلى تيار بروتون كبير السعة عبر IMM للدهون البنية دون إضافة الأحماض الدهنية الخارجية ، وهي المنشطات المطلوبة من UCPs.
بعد التروية إما عن طريق مثبط UCP1 guanosine diphosphate أو 10-millimolar methyl beta cyclodextrin لاستخراج الأحماض الدهنية الغشائية الداخلية ، يتم استخدام التيار المتبقي لتحديد سعة تيارات UCP1 ، والتي تختفي تماما في IMM من الفئران UCP1 الناقصة. على عكس الدهون البنية ، فإن IMM للأنسجة غير الدهنية ، مثل العضلات الهيكلية والقلب ، لا يطور تيارا بروتونيا قابلا للقياس مباشرة بعد الاقتحام. للحث على تيار بروتون قابل للقياس من خلال AAC ، من الضروري تطبيق محلول حمام HEPES الذي يحتوي على واحد إلى اثنين من الميكرومولار من الأحماض الدهنية الخارجية.
للتأكد من أن تيار البروتون المقاس تحمله AAC ، من المهم تطبيق مثبطات محددة ، carboxyatractyloside ، والتي تمنع تماما تقريبا تيار البروتون الموضح في IMM للفئران AAC1-defic. يتم تحقيق تثبيط ثابت ولكن غير كامل لتسرب البروتون إلا عندما يكون ADP موجودا على جانبي الغشاء لتوليد تبادل نيوكليوتيدات نشط عبر AAC. ستؤثر جودة إعداد mitoplast على معدل النجاح في تحقيق تكوين mitoplast الكامل.
من الضروري تحسينه. بمجرد تشريح الآلية الجزيئية للتوليد الحراري للميتوكوندريا باستخدام تقنية المشبك الرقعة ، فإن قياس استهلاك أكسجين الميتوكوندريا سيوضح أهمية تيار البروتون والتوليد الحراري في الميتوكوندريا السليمة. تفتح هذه التقنية الطريق أمام الباحثين لاستكشاف جميع أنواع التوصيلات والأيونات والأيضات المهمة لعمل الميتوكوندريا.
