قياس التدفق الخلوي هو تقنية قوية تسمح بالتحليل متعدد المعلمات للخلايا المفردة. يمكنه تحديد المؤشرات الحيوية لموت الخلايا المبرمج المبكر والمتأخر بدقة وسرعة من خلال تحليل ملايين الخلايا. يتم تلطيخ جزيئات الخلايا المتعددة واكتشافها في وقت واحد.
على وجه الخصوص ، يسمح قياس التدفق الخلوي على مقاعد البدلاء بالتحليل والتفسير من قبل أخصائيي قياس التدفق الخلوي غير الخبراء. وستقوم إستر تشو ، وهي طالبة دراسات عليا من مجموعة سرطان فيتامين (د) ، بتوضيح الإجراء. ابدأ بزراعة مزارع الخلايا في بيئة CO2 رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
تأكد من أن زراعة الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ تقريبا في القارورة الأم قبل تمرير الخلايا لإجراء التجارب. قم بإزالة الوسط من القارورة وغسل الخلايا باستخدام 1X PBS. ثم أضف ملليلتر واحد من التربسين لفصل الخلايا.
بعد أن تبدأ الخلايا في الانفصال ، قم بتحييد التربسين بإضافة ما يقرب من خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج المكمل بمصل العجل الجنيني بنسبة 10٪ قبل عد الخلايا. خلايا البذور في 15،000 خلية لكل ملليلتر في ثلاثة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا في لوحة زراعة الخلايا ستة آبار. احتضان لوحات الاستزراع طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للسماح بربط الخلايا بقاع البئر.
في اليوم التالي ، عالج المزارع التجريبية ب 100 نانوجرام لكل ملليلتر من الأكتينومايسين D والتحكم في الوسط والمذيب باستخدام وسط الاستزراع الطازج و DMSO ، على التوالي ، لمدة 24 ساعة. قم بإزالة الوسط من الآبار وجمع الوسط المستهلك في أنبوب سعة 15 ملليلتر. اغسل الخلايا باستخدام 1X PBS.
أضف 500 ميكرولتر من التربسين لفصل الخلايا. قم بإرجاع الماصة برفق إلى ملليلتر واحد من الوسط مرتين إلى ثلاث مرات لإزاحة الخلايا المتبقية التي لا تزال متصلة بقاع البئر ميكانيكيا. أضف المحلول من الآبار إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر ثم أضف خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج لتحييد التربسين.
ماصة 450 ميكرولتر من الكاشف الذي يحتوي على أصباغ ربط الحمض النووي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
تعداد الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. خفف جميع العينات إلى تركيز واحد في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر باستخدام وسط زراعة الخلايا قبل الانتقال إلى مقايسات موت الخلايا المبرمج. للكشف عن إضفاء الطابع الخارجي على الفوسفاتيديل سيرين باستخدام الملحق V ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.
أضف إلى ذلك 100 ميكرولتر من خليط 1: 1 من الملحق المترافق الفلوري V وكاشف 7-AAD. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، محمية من الضوء. لتحليل إزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا ، ابدأ بالطرد المركزي 100 ميكرولتر من تعليق الخلية عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق ثم تخلص من المادة الطافية.
إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من 1X PBS. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ TMRE إلى كل عينة وامزج التعليق عن طريق السحب الخلفي اللطيف. لف العينات بورق ألومنيوم نظيف لحمايتها من الضوء واحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في بيئة CO2 رطبة عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، أضف حل عمل 7-AAD إلى العينة واخلطها. للكشف عن الكاسباز الطرفي المنشط -3 و 7 ، ابدأ بتخفيف الببتيد المرتبط بالحمض النووي المرتبط ب DEVE في DMSO إلى نسبة 1: 8 مع 1X PBS المعقم لجعل حل الكشف عن caspase يعمل. تخزين الحل على الجليد أو إضافة درجتين إلى ثماني درجات مئوية ، محمية من الضوء.
أضف ميكرولتر من محلول مخزون 7-AAD إلى 148 ميكرولتر من 1X PBS لصنع حل عمل 7-AAD. تخزين الحل على الجليد أو في درجتين إلى ثماني درجات مئوية ، محمية من الضوء. أجهزة الطرد المركزي 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لمدة خمس دقائق في 300 مرة G وتجاهل طاف.
أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولترا من 1X PBS ، متبوعا بخمسة ميكرولترات من محلول عمل الكشف عن الكاسباز واخلطها جيدا. قم بفك غطاء الأنابيب واحتضانها لمدة 30 دقيقة في بيئة CO2 رطبة عند 37 درجة مئوية ، محمية من الضوء. أضف 150 ميكرولترا من محلول العمل 7-AAD لكل عينة واخلطها.
احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. للكشف عن فواصل الحمض النووي مزدوجة الشريط وتلف الحمض النووي الكلي ، قم أولا بطرد مركزي 50 ميكرولترا من تعليق الخلية لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من 1X PBS وأضف 500 ميكرولتر من مخزن التثبيت القائم على الفورمالديهايد واخلطه.
احتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة G وتجاهل طاف المياه. أعد تعليق الخلايا في 90 ميكرولترا من 1X PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق.
أضف 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. أضف 100 ميكرولتر من 1X PBS وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بمعدل 300 مرة G.تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من 1X PBS.
امزج العينة عن طريق سحب العينة برفق قبل تحميل العينة على مقياس التدفق الخلوي. تحقق من الأداء التحليلي لمقياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل مجموعة فحص نظام الجهاز ولا تتابع تشغيل العينات حتى يتم الانتهاء من جميع الفحوصات واجتيازها. أولا ، قم بتحميل عينة تحكم سلبية على مقياس التدفق الخلوي وحدد تشغيل ، ضبط الإعدادات ، بحيث تبدأ الأداة في استنشاق العينة وتوفر معاينة في الوقت الفعلي للأحداث المكتشفة.
باستخدام المعاينة المباشرة، اضبط عتبات التألق وحجم الخلية. ارسم بوابة مستطيلة حول محتوى الخلية ، واسحب علامة العتبة لاستبعاد الحطام الخلوي ، وحدد التالي ، تعيين ملف تعريف موت الخلايا المبرمج للمتابعة. انقر فوق العلامات الرباعية واسحبها لفصل مجموعات الخلايا ورسم الأحداث المكتشفة في الوقت الفعلي.
استخدم هذه المخططات لتوجيه المستخدم النهائي بشأن الموضع المناسب للعلامات الربعية. حدد التالي ، التحقق من الإعدادات للمتابعة حتى تعرض الأداة ملخصا للإعدادات. بعد مراجعة الإعدادات، حدد التالي، إنهاء الإعدادات لتطبيق هذه الإعدادات على جميع العينات داخل التجربة.
امزج العينة الأولى عن طريق سحب العينة الخلفية برفق وقم بتحميل العينة الأولى على مقياس التدفق الخلوي. حدد التالي، ثم قم بتسمية العينة وحدد تشغيل حتى يبدأ النظام في تشغيل العينة. إذا لزم الأمر ، قم بإجراء ضبط دقيق للبوابات أو العلامات الرباعية بعد الاستحواذ.
حدد موقع التجربة التي تحتاج إلى تعديل من خلال التنقل في متصفح ملفات النظام وافتح التجربة. اضغط على معاينة الصورة المصغرة للمؤامرة لتكبيرها. لضبط العلامات الرباعية ، انقر فوق تقاطع الخطوط الرأسية والأفقية لتحريك العلامات كما هي ، واضبط زاوية أي من الخطين بالنقر فوق الخط واسحب المقبض.
لتحسين بوابة الخلية ، انقر فوق علامة التبويب بوابة واضبط أبعاد البوابة. اضبط العلامات حسب الرغبة وقم بتطبيق هذه الإعدادات على جميع العينات في التجربة عن طريق تحديد أيقونة علامة الاختيار ووضع علامة على جميع العينات وتحديد قبول. قم بإجراء الاختبارات في ثلاث نسخ وقم بإجراء تحليل للتباين باستخدام اختبار Bonferroni اللاحق لتقييم الاختلافات المهمة بين العينات والضوابط.
أظهر عدد الخلايا ونتائج صلاحيتها أن 95.2٪ من الخلايا في العينة كانت حية و 4.8٪ ميتة. وجد أن تركيز الخلية يساوي 5.90 في 105 خلايا لكل ملليلتر. أظهر اختبار الملحق V وموت الخلايا زيادة كبيرة في الخلايا المبرمج في خلايا SiHa المعالجة ب 100 نانوجرام لكل مليلتر من الأكتينومايسين D ، مقارنة بالضوابط.
أظهر اختبار إمكانات الغشاء الكهروكيميائي للميتوكوندريا انخفاضا كبيرا في ملامح صحة الخلية بين الأكتينومايسين-D ، والتحكم المتوسط ، والتحكم في المذيبات ، مما يشير إلى أن 100 نانوجرام لكل مليلتر من الأكتينومايسين D تسبب في إزالة استقطاب الميتوكوندريا في خلايا SiHa. أظهر اختبار caspase-3 و 7 تنشيطا كبيرا للكاسباس الطرفي في خلايا SiHa المعالجة ب 100 نانوجرام لكل مليلتر من الأكتينومايسين D ، مقارنة بالضوابط. تسبب الأكتينومايسين D بشكل كبير في علامات تلف الحمض النووي وأجهزة الصراف الآلي و H2A.
X في خلايا SiHa ، مما يشير إلى زيادة كبيرة في تلف الحمض النووي. لتعزيز الدقة ، تأكد من حصاد إجمالي عدد الخلايا. أيضا ، التزم بتركيزات الخلايا الموصى بها من قبل الشركة المصنعة وأوقات التلطيخ.
حماية العينات الملطخة من الضوء يتجنب التبييض الضوئي أو الفلوروفور. يجب دعم التحليل الكيميائي الحيوي لموت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق الفحص المجهري. هذا سوف يحدد السمات المورفولوجية لموت الخلايا المبرمج الكلاسيكية.
تشمل الميزات التكثيف النووي ، ومزج غشاء الخلية ، والأجسام المبرمج ، و karyorrhexis.
