تمكن طريقتنا من تقييم تكوين الخلايا الليمفاوية المختلفة والخصائص الوظيفية لها الموجودة في نسيج الرحم للحيوانات الحامل وغير الحامل. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا الليمفاوية الرحمية مع الحفاظ على التعبير السطحي عن البروتين وقابلية الخلية للحياة والوظائف. ولذلك فهي مناسبة لمجموعة من التطبيقات اللاحقة.
إزالة الجنين في بداية التجربة وجمع الكريات البيض هي خطوات صعبة من الناحية الفنية. نظرا لأنها تجربة طويلة ، ف هناك حاجة إلى اهتمام وتركيز خاصين بمجرد وصولك إلى خطوات تلطيخ الجسم المضاد. للبدء، نقل أنسجة الرحم حصادها من حامل C57 أسود ستة فأر أنثى في طبق بتري عقيمة، ثم باستخدام أدوات معقمة إزالة بلطف الدهون المحيطة الأنسجة، مع الحرص على عدم السماح للأنسجة الجافة.
قم بإزالة الأجنة عن طريق تشريح كل موقع زرع بأدوات معقمة، ثم أعد الرحم إلى أنبوب جمعه الأصلي الذي يحتوي على ملليلتر واحد من وسائط التجميع. باستخدام مقص، فرم الأنسجة في أنبوب جمع، ثم وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية. إضافة ثلاثة ملليلترات من مزيج الهضم الأنزيمي قبل تسخينها إلى الأنبوب.
احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع التحريض لتعزيز نشاط الهضم الأنزيمي. بعد اكتمال الحضانة ، دوامة الأنبوب ، وإبقائه على الجليد لمنع النشاط الأنزيمي ، ثم نقل الأنسجة الهضمية إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر المسمى بشكل صحيح. شطف أنبوب جمع خمسة ملليلتر مع ما مجموعه 10 ملليلتر من الجليد الباردة خمسة ملليمولار EDTA PBS الحل لجمع جميع الأنسجة المتبقية ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
الطرد المركزي عينة الأنسجة المهضومة لمدة 10 دقائق في 400 مرة G.Discard العملاقة، نفض الغبار بلطف بيليه، ومن ثم إعادة إنفاقها في 10 ملليلتر من قبل تسخينها خمسة ملليمولار EDTA PBS الحل. للحد من تكتل الخلايا، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية مع التحريض، تليها دوامة على ارتفاع لمدة 10 ثانية. لإزالة كتل الخلايا في الأنسجة غير المرتبطة، ضع مصفاة 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي معقم 50 ملليلتر، ثم باستخدام المكبس من حقنة معقمة ملليلتر واحد، يجبر الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة في الأنبوب.
غسل مصفاة عدة مرات مع ما مجموعه 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة لجمع جميع الخلايا، ثم قضاء أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر لمدة 10 دقائق في 400 مرة G.After التخلص من supernatant، قد يتم عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية باستخدام الخيار A أو الخيار B.For A، resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من 80٪ متساوي التوتر لكل مكالمة باستخدام صوت ماصة. ثم باستخدام المصصة voy على سرعة بطيئة، تراكب بعناية ثمانية ملليلتر، 40٪ لكل حل الدعوة، على بيليه resuspended في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. ماصة ببطء وباستمرار، عقد 15 ملليلتر إلى حوالي زاوية 45 درجة.
دون إزعاج التراكب ، طارد مركزي الأنبوب لمدة 20 دقيقة بمعدل 850 مرة G مع تسارع متوسط وفواصل دنيا في درجة حرارة الغرفة. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج طبقات كل مكالمة. المقبل دون إزعاج حلقة من الكريات البيض في واجهة اثنين لكل حل الدعوة، واستخدام ماصة البستر العقيمة لتجاهل جميع ما عدا 0.5 إلى ملليلتر واحد من أعلى لكل طبقة الدعوة.
أثناء محاولة الحفاظ على كمية محلول كل مكالمة امتص في ماصة إلى أدنى حد ممكن، وجمع بعناية حلقة الكريات البيض، ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد المسمى 15 ملليلتر. إضافة 10 ملليلتر من المتوسط RPMI المعقمة تكملها 10٪ الحرارة وتنشيط FBS إلى الخلايا، ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق في 500 مرة G وأربع درجات مئوية. تجاهل supernatant والمضي قدما في تحلل خلايا الدم الحمراء.
لعزل الخلايا باستخدام الخيار B، بعد تمرير الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة الخلية والطرد المركزي النتيجة في تعليق الخلية كما هو موضح سابقا، إعادة إنفاق بيليه مع ثمانية ملليلتر من 35٪ متساوي التوتر لكل مكالمة والمتوسطة RPMI، ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر. طرد مركزي الأنبوب في 940 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تسارع متوسط والحد الأدنى من فترات الراحة. ثم باستخدام aspirator أو مصصة فوي، يستنشق supernatant بعناية قبل إعادة تعليق بيليه في 14 ملليلتر من المتوسط RPMI تكملها مع 10٪ الحرارة وتنشيط FBS.
طرد مركزي العينة مرة أخرى لمدة خمس دقائق في 500 مرة G وأربع درجات مئوية، ثم تجاهل supernatant عن طريق الطموح والمضي قدما في تحلل خلايا الدم الحمراء. لإحليل خلايا الدم الحمراء، وإعادة إنفاق العينة في ثلاثة ملليلترات من محلول واحد س خلايا الدم الحمراء الليسينج واحتضان لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في العينة لوقف رد الفعل. الطرد المركزي الأنبوب في 400 مرة G لمدة خمس دقائق بعد التخلص من supernatant، إضافة 10 ملليلتر آخر من برنامج تلفزيوني وتكرار المركزية.
Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة RPMI تكملها مع 10٪ الحرارة تعطيل FBS، ثم تمرير تعليق في الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر معقمة. بعد عد الخلايا ضبط تركيز تعليق الخلية إلى 1-2 مليون خلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني والمضي قدما في تلطيخ وتحليل الفاكس. وتشمل مجموعة الرحم واحدة ILCs خلايا NK التقليدية، خلايا NK المقيمين في الأنسجة، ومجموعة واحدة ILCs مع نسبها المئوية متفاوتة خلال الحياة والحمل.
يمكن التمييز بين هذه المجموعات الفرعية باستخدام قياس التدفق الخلوي عن طريق الخلايا الأولى على قدرتها على تشتت الضوء ، ثم عزل قرص مضغوط واحد قابل للشراء 45 CD إيجابي ثلاث خلايا سلبية CD 19 سلبية ، ومن ثم تحديد المجموعة الأولى ILCs التي هي NK 1.1 و NKP 46 إيجابية. ضمن المجموعة الأولى ILCs، CD49A EMs سالبة إيجابية هي خلايا NK التقليدية. CD49A إيجابي Ems الخلايا الإيجابية هي خلايا NK المقيمين في الأنسجة.
وCD49 إيجابي Ems الخلايا السلبية هي مجموعة واحدة ILCs الرحم. تلطيخ الخلايا الليمفاوية الجنبية والرحمية مع المضادة NK P46 والأجسام المضادة NK 1.1 يظهر أن الخلايا الليمفاوية الجنبية التعبير عن كميات أعلى من NKP 46 على سطحها من نظيرتها الرحمية. في فص الأنسجة الأنزيمية، يمكن تغيير الأسطح السطحية اعتمادا على الإنزيمات المستخدمة في وسيط الهضم.
على سبيل المثال، تلطيخ لمستقبلات MHC CD49 NKG2A ضعيف عند استخدام liberase TM. ومع ذلك الهضم مع liberase DH يحافظ على الاعتراف NKG2A من قبل استنساخ الأجسام المضادة 1611. حوالي 6.5٪ من المجموعة الأولى ILCs الموجودة في عينات أنسجة الرحم في يوم الحمل 8.5 هي مشتقة من الدم.
يمكن استبعاد ملوثات الدم من خلال تلطيخ داخل الجسم مع الأجسام المضادة CD45 المقترنة بالفلوروشروم. عند الإعداد للاجتماعات الزمنية، يجب أن تأخذ بعين الاعتبار أن الفئران ليلية. ولذلك ينبغي إعدادها في وقت متأخر قدر الإمكان في فترة ما بعد الظهر كما سيحدث التزاوج خلال الليل.
أيضا عند اختيار الإناث، يجب التأكد من أنها لم يكن لديك الحاجز المهبلي. نحن عادة ما نقوم بتحليل قياس التدفق الخلوي للنظر في العديد من البروتينات على السطح الخارجي للخلايا وداخل الخلايا. نقوم أيضا باستخراج الحمض النووي لدراسة التعبير الجيني، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي.
ونحن أيضا لا يتمكن من حول المقايسات الوظيفية لدراسة استجابات الخلايا الليمفاوية الفطرية الرحم.
