دراسة تطور الخلايا التغصنية بواسطة ضربة قاضية للجين القصير بوساطة الحمض النووي الريبي في جذع مكون للدم وخط خلية سلف في المختبر

الخلايا التغصنية ، أو DCs ، هي خلايا مناعية رئيسية تربط بين الجهاز المناعي الفطري والتكيفي. في حين أن DCs غير متجانسة ، فإن هذه الطريقة تساعدنا على فهم الجينات ، بما في ذلك عوامل النسخ ، التي قد تنظم تطور DC. توفر هذه التقنية طريقة بسيطة وسريعة لتحديد الجين الذي يتحكم في تطور التيار المستمر من سلفه في المختبر.

للبدء ، حافظ على الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم الخالدة أو iHSPCs في وسط RPMI 1640 الكامل ، مع استكمال 100 نانوغرام لكل ملليلتر من رباط FLT3 واستراديول بيتا ميكرومولار واحد. بالنسبة لنقل الفيروس ، قم بلوحة iHSPCs في 12 لوحة بئر بكثافة واحدة من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر وملليلتر واحد من الوسط الكامل الذي يحتوي على رابط FLT3 وبيتا استراديول والبوليبرين. ثم أضف فيروس lentivirus الذي يحمل الحمض النووي الريبي القصير في كل بئر في عدد كبير من العدوى يبلغ 100.

بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة عند 1100 مرة g و 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، ثم احتضن الخلايا المصابة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة البوليبرين عن طريق جمع الخلايا في أنابيب 15 ملليلتر في الطرد المركزي ، بعد استبدال الوسائط بوسط كامل جديد يحتوي على FLT3 ligand و beta estradiol. بعد 24 ساعة إضافية ، أضف ستة ميكروغرام لكل ملليلتر من البوروميسين إلى الوسط لتحديد الخلايا المصابة.

استبدل وسيط التحديد كل ثلاثة أيام وحافظ على الخلايا لمدة أسبوع واحد على الأقل لتوسيع iHSPCs المحولة بثبات. قم بإنشاء والحفاظ على iHSPCs ضربة قاضية مستقرة ل LacZ و Tcf4 و Id2 في وسط كامل مكمل ب FLT3 ligand و beta estradiol. لبدء التمايز في المختبر ، قم بجمع iHSPCs غير المتمايزة في أنابيب 15 ملليلتر وتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من PBS. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في وسط كامل يحتوي فقط على رابط FLT3 ثم زرعها بكثافة مرتين 10 إلى الخامسة التي تباع لكل ملليلتر في صفيحة بئر 12. بعد ثلاثة أيام ، أضف ملليلتر واحد من الوسط الكامل الطازج الذي يحتوي على رابط FLT3.

بعد يومين إضافيين ، انتقل إلى تحليل الخلايا المتمايزة عن طريق قياس التدفق الخلوي. لتحليل التدفق الخلوي ، قم بماصة الخلايا لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات في اللوحة ثم قم بجمع الخلايا في أنابيب 1.5 ملليلتر. قم بطرد الأنابيب وتخلص من المادة الفائقة قبل إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من مضاد CD16 بواسطة 32 hybridoma supernatant واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق على الجليد. ثم ، أضف الأجسام المضادة المترافقة بصبغة الفلورسنت مباشرة إلى الخلايا واحتضنها لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس وقم بطرد العينة.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس وقم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد الضربة القاضية القصيرة بوساطة الحمض النووي الريبي ل LacZ و Tcf4 و Id2 في iHSPCS ، أظهر تأكيد كفاءة الضربة القاضية بواسطة RTQ-PCR أن التعبير عن الضربة القاضية Tcf4 و Tcf4 تم تقليله مقارنة بالضربة القاضية iHSPCs في LacZ. وقد لوحظت نتائج مماثلة للتعبير عن Id2 في الضربة القاضية Id2 iHSPCs.

بعد زراعة LacZ ضربة قاضية iHSPCs لمدة خمسة أيام ، كان تواتر الخلايا الإيجابية CD11c ، التي تمثل مجموعة الخلايا التغصنية ، حوالي 95 ٪ ومع ذلك ، فإن هدم Tcf4 أو Id2 قلل قليلا من توليد الخلايا التغصنية الإيجابية CD11c. كشف مزيد من التحليل للخلايا التغصنية الإيجابية CD11c المشتقة من ضربة قاضية LacZ iHSPCs أن 70٪ كانت خلايا تغصنية تقليدية بينما كانت 22٪ خلايا تغصنية بلازماسيتويد. ولدت الضربة القاضية Tcf4 iHSPCs نسبة أقل بكثير من الخلايا التغصنية البلازمية التي تتحكم فيها ضربة LacZ.

في المقابل ، ولدت iHSPCs الضربة القاضية Id2 نسبة أقل بكثير من الخلايا المتغصنة التقليدية من عناصر التحكم في ضربة قاضية LacZ ولكن نسبة أعلى من الخلايا التغصنية البلازميتويدية. تزيد عدوى الدوران من كفاءة نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الحامل للفيروس إلى iHSPCs. تتناول هذه التقنية دور عوامل النسخ وتسهل دراسة الجينات الأخرى في نقل إشارات السيتوكين أو التمثيل الغذائي ، والتي من المحتمل أن تشارك في تطوير DC.