ونحن ممتنون لالدكاترة. ماركوس مانز وايرفينغ ويسمان لتوفير الكواشف. نحن نعترف أيضا الخدمات التي يقدمها تدفق Cytometric تحليل والخلية مرفق الفرز الأساسية من الأول ومختبر الأساسية الثانية في كلية جامعة تايوان الوطنية مستشفى الطب وجامعة تايوان الوطنية، على التوالي. وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية، تايوان (المؤسسة الوطنية-EX102-10256SI وطنية لحقوق الإنسان-EX103-10256SI).

تم شراؤها C57BL / 6 الفئران البرية من نوع من المركز الوطني للمختبر الحيوان (NLAC)، تايوان. كانت ولدت كل الفئران وأبقى في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة. تم استعراض البروتوكولات والإجراءات استخدام الحيواني والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من كلية جامعة تايوان الوطنية في الطب (رخصة رقم: 20120075). بالإضافة إلى ذلك، قدم الباحثون كل جهد ممكن لتقليل احتمال الألم والمعاناة، أو ضيق في الحيوانات أثناء أداء التجارب. نفذت جميع الإجراءات الموضحة بها في RT بينما يرتدي قفازات. 1. إعداد AC-6 خلايا الطاعم ملاحظة: AC-6.21 (AC-6 في القصير) خط خلية انسجة 18 (التي قدمها أولا ويسمان، جامعة ستانفورد) ينبغي الحفاظ في RPMI تستكمل مع 15٪ مصل بقري جنيني للحرارة المعطل (FBS). لتكون بمثابة الخلايا المغذية، AC-6 الخلايا جاما المشع مع 3000 راد (30Gy) قبل الثقافة المشتركة لمنع انتشارها يوم واحد. ملاحظة عشرفي AC-6 خلايا تميل الى فقدان القدرة على دعم التمايز في حال ترك مكتظة أثناء الصيانة، أو إذا كان عدد مرورهم أكثر من 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل AC-6 خلايا مرة واحدة مع 1 مل Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) وإزالة DPBS بواسطة الطموح. علاج AC-6 خلايا مع 0.8 مل من محلول التربسين (0.05٪ التربسين و 0.5 ملي EDTA في DPBS) لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ثم وقف رد فعل عن طريق تمييع مع 10 مجلدات من مستنبت ل جعل تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور AC-6 خلايا في 5.9x10 4 خلايا / جيد في لوحات 12-جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 O / N. ملاحظة: إن كثافة AC-6 خلايا مهمة للغاية حيث كثافة أقل نرجح الجيل CDC. البذر في كثافة 5.9x10 4 خلايا / جيد سيسمح AC-6 للوصول إلى confluency في اليوم التالي، والذي هو الأمثل لاشتقاق pDCs من CLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق AC-6 خلايا في 3000 راد (30 غراي) باستخدام جاما-irradiator. ملاحظة: تم تحسين الجرعات المستخدمة لأشرق AC-6 لمنع الخلايا من التكاثر وبعد الاحتفاظ بها قابلة للحياة طويلة بما يكفي لتوفير السيتوكينات وخلية خلية الاتصال اللازمة لتمايز البلدان النامية من CLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة واستبدالها مع 1 مل كامل RPMI (RPMI مع الحرارة المعطل 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 50 ميكرومتر β المركابتويثانول). </li></ol> 2. عزل خلايا من الفئران BM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران عن طريق CO 2 الخنق وخلع عنق الرحم. وضع الفئران في علبة تشريح وتعقيم مع الايثانول 70٪. إجراء شق في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء الأعلى من الفأرة بما في ذلك الجلد المغطي للالسفلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الفئران في غطاء شبه عقيمة. الإفراج عن عظم الفخذ والظنبوب، مقطع عظم الفخذ والظنبوب فوق تحت مفصل الركبة. فصل العضلات من العظام باستخدام مقص ووضع العظام في طبق بتري 6 سم تحتوي على 5 مل إكمال RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى غطاء الثقافة العقيمة. ملء حقنة 3 مل متصلة إبرة 27G مع كامل RPMI. قطع طرفي العظام باستخدام مقص، وادخال الإبرة 27G لطرد نخاع من العظام عن طريق حقن بلطف كاملة RPMI مرة واحدة من كل طرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية واحدة من قبل pipetting لطيف الخلايا صعودا وهبوطا 3-5 مرات في صحن الثقافة باستخدام حقنة من دون إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ج وصب طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز خلايا الدم الحمراء مع 1 مل ACK العازلة (150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3، 0.1 ملي EDTA) حضانة لمدة 1 دقيقة، ووقف رد فعل عن طريق تمييع مع 10 مجلدات كاملة من RPMI. تسمح للخلايا للوقوف لمدة 5 دقائق لبيليه أسفل كتل الخلايا الميتة والبقايا الأنسجة عن طريق الجاذبية. ملاحظة: لا تقف أكثر من 5 دقائق لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان الخلايا بسبب تسوية من خلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب ببطء طاف التي تحتوي على خلية إلى حطام جديد أنبوب مغادرةوراء في الأنبوب الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج لخلايا بيليه، ثم إزالة والتخلص من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend مجموع الخلايا BM (عادة يتم الحصول على 4-6 × 10 7 BM الخلايا من الماوس واحد) في 100 ميكرولتر FACS العازلة (1X PBS + 2٪ FBS + 1MM EDTA). </li></ol> 3. FACS تحليل وفرز من CLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة معاداة CD16 / 32 (هجين supernant استنساخ 2.4G2، 50 ميكرولتر / رد فعل أو 1-2 ميكروغرام / رد فعل) إلى خلايا في المخزن FACS (الخطوة 2.9) لمدة 1-2 دقيقة من أجل منع مستقبلات لكرة القدم. ملاحظة: مكافحة CD16 / 32 وتسمى أيضا كتلة التيسير، الذي يضاف لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة لمستقبلات الخلايا معربا عن التيسير بما في ذلك المحببة، وحيدات، والخلايا الليمفاوية B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في وقت واحد الخلايا مع الأجسام المضادة بعد الفلورسنت المسمى صبغ (ل4x10 7 الخلايا) لمدة 15 دقيقة على الجليد، وتجنب الإضاءة المحيطة. الأجسام المضادة: علامات النسب PE-مترافق (0.2 ميكروغرام لكل منهما) بما في ذلك مكافحة CD3 (17A2)، ومكافحة CD8 (53 حتي 6،7)، ومكافحة B220 (RA3-6B2)، ومكافحة CD19 (eBio1D3)، ومكافحة CD11b (M1 / 70)، ومكافحة GR-1 (RB6-8C5)، ومكافحة Thy1.1 (HIS51)، ومكافحة NK1.1 (PK136)، ومكافحة TER119 (TER-119)، ومكافحة MHC-II (نمر-4)، 0.2 ميكروغرام المضادة للج-كيت-PerCP-Cy5.5 (2B8)، 1 ميكروغرام المضادة للهيئة السلع التموينية-1-FITC (D7) و 0.4 ميكروغرام المضادة للM-CSFR-APC (AFS98)، و 0.2 ميكروغرام المضادة للIL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 3 مل FACS العازلة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 300 FACS ميكرولتر العازلة والخلايا مرشح من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أنبوب مع إضافي 100 ميكرولتر FACS العازلة لاسترداد أي الخلايا المتبقية وتصفية إلى FACS معقمة الفرز أنبوب باستخدام نفس مصفاة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل تدفق cytometric مباشرة بعد تلطيخ باستخدام مرشحات والفولتية المناسبة للكشف عن إشارة. استخدام 488 نانومتر ليزر للكشف عن الأجسام المضادة FITC-، PerCP-Cy5.5 المسمى، 561 نانومتر ليزر للكشف عن الأجسام المضادة PE- وPE-Cy7 labelded-و 633 نانومتر لاسإيه للكشف عن الأجسام المضادة APC المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز CLPs وفقا للعلامات التالية لين - ج طقم الباحث هيئة السلع التموينية، 1 الباحث M-CSFR - IL-7Rα + (كما الملون في الخطوة 3.2) باستخدام فارز الخلية. جمع الخلايا مرتبة في أنبوب 15 مل تحتوي على 8 مل من RPMI بمثابة وسادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل العدد المطلق للخلايا مرتبة كما هو موضح من قبل فارز الخلية في نهاية المدى. عادة، يمكن الحصول على 5X10 4 CLPs من BM من الماوس واحد. </li></ol> 4. Coculture CLPs وAC-6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا مرتبة من الخطوة 3.7 لمدة 10 دقيقة في 500 x ج، وإزالة طاف و resuspend بيليه الخلية مع ما يكفي من كامل RPMI للحصول على كثافة الخلايا في جميع أنحاء 5X10 4 خلية / مل. البذور 500 خلية / جيدا في لوحة ال 12 أيضا التي تحتوي على الخلايا المغذية التي أعدت في الخطوة 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 نانوغرام / مل FL 19 (HU-Flt3L مكتب المفتش العام ولدت في المنزل باستخدام نظام التعبير التي تقدمها M. مانز، Universiمستشفى تاي زيورخ، سويسرا)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 مع رصد بصرية الدوري DC تنمية تحت المجهر. ملاحظة: المتاحة تجاريا FL البشري المؤتلف أو الماوس FL يمكن استخدامها كبديل للHU-Flt3L مكتب المفتش العام لدعم DC التنمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا في طاف في اليوم 12، ويغسل الآبار مرة واحدة مع 0.5 مل إكمال RPMI المتوسطة الجمع بين supernatants الناتجة عن ذلك. إضافة 0.5 مل متوسطة جديدة والغاء الخلايا الملتصقة مع مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين المتوسطة التي تحتوي على خلية من كل أجزاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا طاف و resuspend صب في 50 ميكرولتر FACS العازلة. إضافة 50 ميكرولتر مكافحة CD16 / 32 هجين طاف واحتضان لمدة 1-2 دقيقة لمنع مستقبلات لكرة القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد وصمة عار جميع الخلايا مع الأجسام المضادة التالية (0.05 ميكروغرام لكل منهما) لمكافحة CD11c و-APC (N418)، ومكافحة CD11b-FITC، ومكافحة B220-PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا كما وصفد في الخطوة 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة، البوابة على CD11c و+ وتحليل لجان تنمية المجتمعات المحلية (CD11c و+ CD11b + B220 -) وpDCs (CD11c و+ CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation.">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li><li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell+lineage:+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting.">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li><li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets.">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li><li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+homeostasis.">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li><li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells.">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li><li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors.">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li><li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3.">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li><li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+differentiation:+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells.">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li><li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin.">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li><li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells:+recent+progress+and+open+questions.">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors.">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule.">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li><li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development.">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li><li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells.">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li><li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines:+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024.">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential.">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21.">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li><li>Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand.">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

نحن هنا وصف في المختبر نظام الثقافة للجيل قوي من البلدان النامية، وpDCs على وجه الخصوص، من عدد صغير من CLPs. ويرجع ذلك إلى استخدام AC-6 خلايا، خط خلية اللحمية، كما مغذيات تفرد هذا النظام الثقافة. وقد تبين هذا النهج لتوفير ليس فقط السيتوكينات، مثل IL-7، SCF، M-CSF وFL 20، ?...

الخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا العارضة للمستضد المهنية التي تلعب دورا هاما في السيطرة على الاستجابات المناعية 1. بينما البلدان النامية غير متجانسة، فإنها يمكن تصنيفها إلى قسمين السكان، البلدان النامية التقليدي (جان تنمية المجتمعات المحلية) والبلدان النامية بلازماوية الشكل (pDCs) 2،3. بالإضافة إلى الأجهزة اللمفاوية، تم العثور جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs أيضا في الأنسجة بما في ذلك الرئة والأمعاء، والجلد 2. مورفولوجية جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يختلف، مع جان تنمية المجتمعات المحلية واظهار التوقعات تشبه التغصنات وشكل pDCs يجري مثل خلية المزيد من البلازما. بالإضافة إلى ذلك، الماوس المشترك DC علامة، CD11c و، وأعرب أكثر إلى حد كبير على جان تنمية المجتمعات المحلية من على pDCs. وعلاوة على ذلك، جان تنمية المجتمعات المحلية ويمكن تقسيمها الى مزيد من CD11b + CD24 - جان تنمية المجتمعات المحلية وCD11b - CD24 + جان تنمية المجتمعات المحلية، وكلاهما تعبير عن مستويات أعلى من الدرجة MHC II والجزيئات costimulatory من القيام pDCs 2. pDCs ناضجة، من ناحية أخرى، وقد ثبت للتعبير بشكل انتقائي Siglec-H وBST2 4. Functionally، جان تنمية المجتمعات المحلية والمستضد أفضل عرض الخلايا من هم pDCs. ومع ذلك، يمكن pDCs تنتج كمية هائلة من النوع الأول إنترفيرون على عدوى فيروس أو التحفيز التهابات 5. كلا جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs وقصيرة الأمد، وبالتالي، يجب أن تتجدد باستمرار من الأسلاف في نخاع العظم (BM) 6،7. نقل بالتبني من الأسلاف المشتركة الدم النخاعي (CMPS) والأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في الفئران قاتل المشع يوضح أن جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs يمكن أن تتولد من كل الأنساب 10/08. ومع ذلك، هناك مجموعة فرعية من pDCs التي تعبر عن RAG1 / 2 وتمتلك قطاعات DJ ترتيبها في موضع IGH 11،12. كما شارك هذه الخلايا الجزيئية التشابه مع الخلايا الليمفاوية B، بما في ذلك التعبير عن علامة B220، الاستشعار الحمض النووي مستقبلات (TLR7 / TLR9)، وعوامل النسخ (Spib وBcl11a) 13، ويضم كل يعتقد أن التوقيعات على النسب اللمفاوية. ولذلك، CLPالصورة قد تكون خيارات جيدة للجيل في المختبر من pDCs بسبب النسب التشابه. في حين أن تردد كل من جان تنمية المجتمعات المحلية وpDCs في البشر والفئران منخفض جدا 6، البلدان النامية، ولا سيما جان تنمية المجتمعات المحلية، يمكن أن تتولد في المختبر من BM أو الأسلاف في حضور السيتوكينات، مثل GM-CSF 11،14 أو Flt3 يجند (FL ) باستخدام أنظمة خالية المغذية 11،15،16. لسوء الحظ، ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن لإنتاج أعداد كبيرة من pDCs في المختبر باستخدام FL 11،15،16. سابقا أثبتنا أن pDCs يمكن أن تتولد بكفاءة في المختبر من CLPs باستخدام نظام AC-6 التغذية 17. وميزة استخدام خط الخلية انسجة AC-6 في نظام الثقافة هو أنه يوفر اتصال خلية خلية وإفراز السيتوكينات التي تدعم توليد أعداد كبيرة من pDCs من CLPs. على الرغم من أن الإنتاج مع هذا النظام قوي جدا، والنسخ دقيق للإجراءات المبينة أدناه مطلوب طالدرجة n لضمان جيل كفاءة pDCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108408</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108708</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse&#160; CD11b (PE), cloneM1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101208</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115508</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>linage marker/FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100308</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100707</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107608</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116208</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135510</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105824</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108106</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135014</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS sorting tube&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>Flow analysis sofrware</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of murine plasmacytoid dendritic cells from common lymphoid progenitors using the ac-6 feeder system

الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs) هي نوع قوي I إنترفيرون (IFN-I) المنتجة للخلايا التي يتم تفعيلها في الاستجابة للعدوى أو أثناء الاستجابات الالتهابية. للأسف، إن ما يعرقل دراسة وظيفة PDC بواسطة التردد المنخفض في الأجهزة اللمفاوية، والأساليب القائمة لفي المختبر الجيل DC يفضلون في الغالب إنتاج جان تنمية المجتمعات المحلية على pDCs. هنا نقدم نهجا فريدا لتوليد بكفاءة pDCs من الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs) في المختبر. على وجه التحديد، وصفت البروتوكول تفاصيل كيفية تنقية CLPs من نخاع العظام وتوليد pDCs التي كتبها coculturing مع AC-6 الخلايا المغذية-المشع γ في وجود Flt3 يجند. ومن الخصائص الفريدة لهذا النظام الثقافة هي أن CLPs تهاجر تحت الخلايا AC-6 وتصبح الخلايا المكونة للمنطقة حصوه، خطوة حاسمة لتوسيع pDCs. تم إنشاء البلدان النامية متميزة شكليا، وهي pDCs وجان تنمية المجتمعات المحلية، وبعد ما يقرب من 2 أسابيع مع تكوين 70-90٪ pDCs تحت الظروف المثلى. عادة، وعدد من pDCs التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب هو ما يقرب من 100 أضعاف عدد CLPs المصنفة. لذلك، هذا هو نظام الرواية التي لتوليد بقوة الأعداد الكبيرة من pDCs اللازمة لتسهيل إجراء المزيد من الدراسات في تطوير وظيفة هذه الخلايا.

وعادة ما يتم عزل ما مجموعه 4-6x10 7 خلايا BM من عظام الفخذ والظنبوب واحدة 6-8 أسبوع عمره، من النوع البري C57BL / 6 الماوس. لفرز CLPs، هي ملطخة مجموع الخلايا BM مع الأجسام المضادة PE مترافق ضد علامات النسب (CD3، CD8، B220، CD19، CD11b، GR-1، Thy1.1، NK1.1، TER119، وMHC-II)، ومكافحة -c-كيت-PerCP / Cy5.5، ومكاف?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System at JoVE.com

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

8.3K Views.  National Taiwan University College of Medicine. In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. 

Video: In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...