إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

تعتمد وظائف البروتينات على درجة الحرارة وهي مثالية عند درجة الحرارة. يوفر هذا البروتوكول طريقة لحل هياكل البروتين في درجات حرارة أعلى. يمكن أن يوفر هذا النهج هياكل ذات صلة وظيفيا ويعزز فهم الاعتماد على درجة حرارة هياكل البروتين.

وسيوضح الإجراء يوان تشيه تشانغ ، مدير منشأة أكاديمية سينيكا كريو EM. ابدأ بعمل ثقب سنتيمتر واحد في أنبوب طرد مركزي 50 ملم في نهايته المغلقة. ضع الأنبوب في غرفة جهاز التزجيج عند مخرج المياه بالموجات فوق الصوتية.

قم بإعداد درجة حرارة جهاز التزجيج إلى درجة الحرارة المحددة ، واسمح لغرفة جهاز التزجيج بالوصول إلى 55 درجة مئوية ورطوبة نسبية 100٪. دعها تقف لمدة نصف ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في الظروف قبل بدء التجربة. ضع الحمام المائي على صفيحة ساخنة واضبط الصفيحة الساخنة على درجة الحرارة المطلوبة.

تحقق من ذلك باستخدام ميزان حرارة للتأكد من أن الماء يصل إلى 55 درجة مئوية. احتضن العينة في الحمام المائي ، وقم بتسخين طرف الماصة على حافة الصفيحة الساخنة لمدة دقيقتين أو أكثر قبل تجربة النشاف. تفريغ التوهج شبكة مدعومة بالكربون في هولي عند 25 مللي أمبير لمدة 30 ثانية.

ضع ورقة ترشيح التزجيج في غرفة جهاز التزجيج في موعد لا يتجاوز خمس دقائق قبل تجربة النشاف. احتضان الملقط مع الشبكة في جهاز التزجيج لمدة دقيقتين أو أكثر. قم ببناء حاوية الإيثان مع الإيثان وفقا للإجراءات القياسية ، مما يضمن عدم فيضان الإيثان.

استخدم ماصة لتطبيق سبعة إلى تسعة ميكرولترات من العينة على الشبكة. ثم انتظر لمدة ثانية إلى ثانيتين ، ولطخت لمدة ثانية إلى ثانية ونصف ، وسرعان ما تغرق العينة في الإيثان السائل. انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى صندوق التبريد المخزن في النيتروجين السائل.

قم بقص الشبكات وتفريغها للحصول على المجهر الإلكتروني أو أداة Cryo EM. استخدم شاشة العرض الخاصة بجهاز Cryo EM ووظيفة الجرعة المنخفضة للبرنامج ، لفحص حالة الجليد على الشبكة وتوزيع العينة على الشبكة. إذا لم تكن جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر عملية إعداد الشبكة بظروف متنوعة مثل وقت الانتظار ووقت النشاف وما إلى ذلك.

إذا كانت جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر نفس الخطوات لإنشاء شبكات عند درجة حرارة مختلفة. انقل الشبكات ذات النوعية الجيدة إلى أداة Cryo EM عالية الدقة. إجراء جمع البيانات وتحليلها وفقا للإجراءات المعمول بها.

في حالة الشبكة الناجحة ، يتكون تدرج الجليد من جليد أكثر سمكا في أعلى يسار الشبكة وجليد أرق في أسفل اليمين. ولوحظت مربعات زرقاء وخضراء مناسبة لجمع البيانات في الشبكة الناجحة. لوحظ تباين مشرق في الشبكة الأخرى.

تشير إلى طبقة رقيقة من الجليد أو غياب الجليد. تم العثور على مربعين فقط مناسبين لجمع البيانات في الشبكة الثانية. تألفت إحدى الشبكات من الجليد في الغالب في شكل بلورات ، والتي كانت غير مناسبة لجمع البيانات.

من ناحية أخرى ، أظهرت الشبكة الأخرى أن الطبقة الجليدية كانت في الغالب في حالة غير متبلورة مناسبة لجمع البيانات. يجب أن يكتمل إعداد الحاوية وغيرها وفقا لنقطة زمنية. التحكم في الوقت وإنهاء التجربة بسرعة ودقة هي الأكثر أهمية.

اعتمادا على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول ، قد يتعين على الباحث أن يكون أكثر حذرا في إعداد الشروط البسيطة.