سوف الكرويات خلايا سرطان الثدي الموصوفة هنا تسمح للباحثين للتحقيق في الآليات الجزيئية للتفاعلات الخلايا البطانية الخلايا السرطانية التي تشارك في انتشار وانبثاث الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذا النموذج 3D هو أنه يوفر ترتيب الخلوية أكثر واقعية أن يحسن موثوقية الاستدلالات بشأن الفيزيولوجيا المرضية وعلاج سرطان الثدي. إثبات الإجراء سيكون جيوفانا أزاريتو، طالبة دكتوراه من مختبري.
ابدأ بعلاج أو إعادة إصابة الخلايا المطلية لمدة 24 ساعة، أو حسب الرغبة. لتحديد توزيع الخلايا في كروية، اغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من محلول الملح المتوازن Hanks'أو HBSS، الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم والبقاء في HUVECs باستخدام 0.5 ميكروغرام لكل صبغة زرقاء ملليلتر. وخلايا MCF-7 باستخدام 0.5 صبغة خضراء ميكرومولار مخففة فيما يتعلق متوسط النمو.
ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية وخمسة في المائة لمدة 30 إلى 40 دقيقة. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من HBSS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف ملليلتر واحد من إعادة عامل مفرزة الأنزيمية، وهو 0.25٪ تريبسين لHUVEC و 0.5٪ رحلات في أربع MCF-7 إلى كل طبق بني باستخدام ماصة P1000.
انتخاب كل نوع الخلية بشكل منفصل في خمسة ملليلتر جولة أنبوب البوليسترين القاع, وإضافة ملليلتر واحد من 10٪ مصل العجل الجنين أو FCS المتوسطة باستخدام ماصة P1000 لوقف رد الفعل الأنزيمي. ثم الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 مرة G لمدة خمس دقائق. يستنشق بعناية supernatant وتعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الستيرويد المتوسطة الحرة.
استخدام 100 ميكرولتر من كل تعليق الخلية المخفف مع 10 ملليلتر من ديلونت 2 لتحديد العدد الإجمالي للخلية. قم بتشغيل الجهاز وامسحه بالضغط على أزرار الوظيفة والبدء، مع حل Diluent 2 في قارورة عداد الخلية. استخدام إعداد أربعة واضغط بدء لقياس فارغة مع حل Diluent 2 الطازجة.
تغيير قارورة التلألؤ مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 10 ملليلتر من محلول ديلونت 2. استخدام إعداد أربعة واضغط على بدء لقياس العينات. لاحظ عدد الخلايا لكل ملليلتر على الشاشة الرقمية، ثم قم بإعداد خمسة ملليلترات من كل تعليق للخلية واخلطها للحصول على حجم نهائي من 10 ملليلترات بنسبة واحدة إلى واحدة، باستخدام ماصة مكررة يدوية لإخراج 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة U-bottom ذات 96 بئرا.
ضع اللوحة في حاضنة تحت ظروف زراعة الأنسجة القياسية وتحقق من تكوين كرويدات بعد 48 ساعة. التقاط صور لهذه كرويدات في 40 X التكبير باستخدام النقيض من المرحلة أو المجهر ستيريو مضان. لإعداد ثقافة إسقاط شنقا مزيج تعليق الخلية في نسبة واحد إلى واحد للحصول على حجم النهائي من اثنين من ملليلتر.
استخدام ماصة P20 لرؤية خليط الخلية في شكل قطرات 15 ميكرولتر على الرصاص المقلوب من طبق بيتري 10 سم. عكس الغطاء مع قطرات وإضافة خمسة ملليلتر من EBM-2 قاعدة المتوسطة في الجزء السفلي من الطبق لتجنب تبخر قطرات. جمع ما يقرب من 50 كروية في أنبوب 1.5 ملليلتر مع غيض من القناة الهضمية من ماصة P200 ميكرولتر.
السماح لهم لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية ومن ثم تجاهل supernatant. إصلاح هذه كرويات مع 500 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغلي 2٪ نوبل ألغور الحل في برنامج تلفزيوني باستخدام لوحة ساخنة مع ضجة مغناطيسية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لإذابة مسحوق يبشر بالخير تماما وتبريدها إلى حوالي 60 درجة مئوية.
إزالة PFA مع ماصة P1000، وغسل هذه كرويدات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني والسماح لهم الرواسب. استقر مرة واحدة تجاهل supernatant بعناية ماصة 600 ميكرولتر من محلول أغورا في أنبوب 1.5 ملليلتر مع كرويدات ووضع الأنبوب على الفور في جهاز طرد مركزي مع الدوار الأفقي في 177 مرة G لمدة دقيقتين. إضافة سلسلة قصيرة في منتصف الحل الزراعي لإزالة بسهولة المكونات من الأنبوب.
ترسيخ المكونات Agros على الجليد، أو في أربع درجات مئوية إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 ملليلتر لتجنب تجفيف بيليه. الحصول على صور من المقاطع كروية باستخدام مجهر ستيريو. حساب كمية الحل اللازمة لإضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من خليط من الكالسيوم Aam وethidium homodimers المخفف باستخدام EBM-2 في نسبة 1 إلى 50.
إضافة خليط تلطيخ إلى كرويدات ووضع لوحة في الحاضنة تحت المعيار، وظروف زراعة الأنسجة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. الحصول على الصور في 40 X التكبير باستخدام المجهر ستيريو مضان. في لوحات U-bottom لوحظ تشكيل كرويدات بعد 48 ساعة من بذر MCF سبع خلايا.
ومع ذلك ، لم يلاحظ تشكيل كرويدات في حالة الخلايا البطانية أو الخلايا اللمفاوية. البذر MCF سبعة بالإضافة إلى الخلايا البطانية أو MCF سبعة بالإضافة إلى الخلايا اللمفاوية بنسبة واحد إلى واحد أدى أيضا إلى تشكيل كروي. تم تسجيل نمو متتابع يعتمد على الوقت لسبع كرويات MCF تتراوح بين 24 إلى 120 ساعة.
زاد حجم الكرويات من حوالي 100 ميكرومتر إلى حوالي 200 ميكرومتر على مدى خمسة أيام. مع زيادة معدل النمو لوحظ في كرويدات تعامل مع محفز النمو. لم يظهر هيكل كرويدات وشكل خلاياها أي شذوذ بعد العدوى مع أوليغونوكليوتيدات التحكم في وجود ليبوفيكتامين.
تم توزيع الخلايا التي تعبر عن علامة التكاثر كي-67 بشكل متجانس في هذه الكرويات. Cleave إلى caspase ثلاثة تلطيخ من هذه الكرويات أظهرت الخلايا اللامبالاة بعد أربعة أيام من الثقافة. دراسة الخلايا في هذه الكرويات مع CD-31 وكي-67 كشفت أن 55٪ من الخلايا هي الظهارية 45٪ هي البطانية و 25٪ من الخلايا تتكاثر.
لتقييم النسبة المئوية للخلايا الحية والميتة كانت كرويدات عمرها أربعة أيام ملطخة بالكالسيوم Aam وethidium-homodimer. وكشف كرويد الفكر الطازج وصمة عار أيضا للخلايا الميتة والحية أن كرويدات حساسة جدا لظروف التجمد. عند اتباع بروتوكول له، تأكد من أن يتم استخدام خلايا صحية لخلط أفروديت شيء آخر أن نتذكر أن يكون لتجنب إتلاف هذه أفروديت خلال كاب DP للحصول على أقسام جيدة أيضا ضمان الحنك أفروديت قبل عبر البوليمرات.
ويمكن زيادة تحسين هذا النموذج من خلال تضمين خلايا أخرى، مثل الخلايا الليفية المشاركة في تطور الورم واستخدامه لتقييم فعالية العوامل العلاجية التي تستهدف نمو السرطان.
