هنا ، قمنا بإظهار بروتوكول الحصول على الخلايا الجيدة والقابلة للحياة والحفاظ عليها لاستخدامات الخطوات العلاجية ، مثل ضخ خلايا اللحمة المتوسطة متعددة القدرات. الميزة الرئيسية لذلك ، أنه باستخدام هذه التقنية ، يمكننا الحصول على حجم الخلية القابل للحياة مقابل الوقت المكتسب في خطوة عزل الخلايا عن الأنسجة التي تم جمعها. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل جميع الأمراض أو الحالات التي يتم فيها تطبيق الطب غير المتجانس والعلاج الخلوي.
يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على اختبار الاستقرار الخلوي في مجالات مثل اختبار الأدوية ، حيث يمكن تشجيع مزارع الخلايا طويلة الأجل. عند التلاعب بالخلايا الحية ، كن هادئا وواثقا. توخ الحذر الشديد مع الإنتان وكن متيقظا باستمرار بعيون العالم لمراقبة أي محنة واتخاذ قرارات جيدة.
ابدأ بوزن الكيس وقياس درجة الحرارة باستخدام مقياس حرارة سريري رقمي غير متصل بالأشعة تحت الحمراء. اترك الكيس لمدة خمس دقائق داخل غرفة التدفق الصفحي لترسيب الطبقات الدهنية وفصل الأنسجة التي تحتوي على الخلايا. حقن 100 ملليلتر من DPBS مع الكالسيوم في كيس النقل واخلطه باليدين.
دعها تقف لمدة خمس دقائق. ثم استخدم حقنة سعة 60 ملليلتر متصلة بمحول الكيس للتخلص من معظم السائل القاعدي الذي يترسب. كرر هذه العملية مرتين.
أضف 100 ملليلتر من محلول الهضم إلى الكيس ، واتركه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التقليب البطيء. ثم انقل جميع محتويات الكيس إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر وقم بطردها بالطرد المركزي عند 400 جرام لمدة 10 دقائق عند 22 درجة مئوية. تخلصي من المادة الطافية وأضيفي 5 ملليلتر من DMEM منخفض الجلوكوز المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 20٪ إلى حبيبات الخلية.
امزج محلولا جديدا من 10 ميكرولتر من التربان الأزرق بنسبة 0.05٪ في الماء المقطر مع 10 ميكرولتر من التعليق الخلوي لمدة خمس دقائق. استخدم مجهرا ضوئيا مقلوبا عند تكبير 20X وعد الخلايا القابلة للحياة في غرفة عد خلايا نيوباور. قم بتعليق حبيبات الخلية في وسط واقي من البرودة بتركيز 1 مليون خلية لكل ملليلتر.
ثم ضع 1 ملليلتر من هذا الخليط في قوارير التبريد. استخدم حاوية تجميد بمعدل تبريد 1 درجة مئوية في الدقيقة وتخزينها في 80 درجة مئوية لمدة عام واحد. بعد عام ، قم بتخزينه في صناديق كاسيت قياسية مغمورة في مرحلة بخار النيتروجين السائل.
يتم عرض البيانات من خطوات مختلفة من الإجراء من المرضى التسعة في هذا الجدول. وفقا للعائد الخلوي الأولي ، تم تحديد حجم متغير من الخلايا لكل عينة. 1 ملليلتر من العينات ذات العائد الخلوي الأعلى ، 1.1 ملليلتر للعينات ذات العائد الخلوي المتوسط و 2 ملليلتر لكل عينة ذات عائد خلوي أقل.
اختلف العائد الخلوي قبل مرور واحد على نطاق واسع حتى عندما لوحظ نفس الالتقاء قبل التربسين. لذلك ، هنا قد تكون الخلايا قد نمت في طبقات. تظهر الصورة التمثيلية ADSCs الوسيطة الملتصقة بالبلاستيك عند الممر الأول بعد العزل في المجهر الضوئي.
تظهر الخلايا التصاق بالتشكل الشبيه بالبلاستيك والخلايا الليفية. تظهر هنا الخلايا القابلة للحياة التي تم عدها في غرفة نيوباور في مقايسة تريبان الزرقاء. يتم عرض بيانات قياس التدفق الخلوي من ستة مرضى في هذا الجدول.
من هذه الخلايا السلبية CD45 ، تم تحديد النسبة المئوية ل ADSCs مع مجموعات مختلفة من علامات الخلايا الجذعية. تظهر الصور التمثيلية المجموعة الفرعية للخلايا الإيجابية للعلامات المرتبطة بالخلايا الجذعية في SVF للحالة التاسعة بعد ثمانية أشهر من الحفظ بالتبريد. هنا ، R1 هي المنطقة الخلوية الكلية التي تم تحليلها في مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي.
و R2 هي المنطقة السالبة CD45. مجموعات CD73 و CD90 و CD105 إيجابية في هذه المنطقة. يوضح هنا تمايز ADSC في الخلايا الغضروفية والخلايا العظمية والخلايا الشحمية.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر أن تحرك ببطء ، ويفضل أن يكون ذلك باليدين ، مع ترك 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمراقبة الالتصاقات والبثور. حافظ على درجة حرارة غرفة العمل حوالي 25 درجة مئوية ، وتجنب أي صدمة حرارية في درجات حرارة أكبر بكثير. يمكن استخدام التقنية الموضحة هنا لعزل خلايا اللحمة المتوسطة متعددة القدرات بنجاح عن الأنسجة الأخرى.
