إن طريقتنا الخالية من العوامل الخارجية للعزل والتوسع في المختبر للخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون هي الحل لمخاوف السلامة البيولوجية حول العلاج بالخلايا عند النظر في تطبيقه الانتقالي. طرق العزل والتوسع لدينا سهلة التكرار وسريعة ومنخفضة المتطلبات الفنية ، مما يجعلها مفيدة للجميع. نحن نحقق في استراتيجية العلاج القائمة على الخلايا الجذعية الدهنية البشرية لإصلاح الأعصاب الطرفية.
ومع ذلك ، يمكن تطبيق تقنيتنا على نطاق واسع عند الحاجة إلى خلايا جذعية دهنية جديدة في إعدادات البحوث السريرية المختلفة. لقد أبقينا الأمر بسيطا للحفاظ على قابلية إنتاج أسهل. يجب مراعاة العقم بعناية من غرفة العمليات حتى زراعة الخلايا.
لمعالجة العينات والشظايا ، يكون التشريح الجزئي معرضا لخطر التلوث. بعد الحصول على عينة الأنسجة الدهنية من الجراحة التجميلية للبطن ، باستخدام مقص معقم ، قم بتقطيعها إلى قطع تبلغ مساحتها سنتيمترا مربعا واحدا تقريبا. باستخدام مشرط ، قم بتشريح كل قطعة إلى أجزاء أصغر وتفريق خمس شظايا في طبق بتري 10 سم.
لتركيب الشظية ، استخدم مشرطا لإنشاء شقوق على السطح البلاستيكي واسحب كل جزء. برفق ، أضف 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الكامل لتغطية جميع الأجزاء دون فصلها واحتضان طبق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. راقب توسع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون ، أو HASC ، يوميا تحت المجهر الضوئي حتى تصبح الخلايا متقاربة.
استبدل الوسط بوسيط كامل جديد كل 72 ساعة لإزالة بقايا الخلايا والسماح لها بالنمو حتى الممر الأول. بمجرد أن تصل مزرعة HASC إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، قم بإزالة وتجاهل جميع قطع الأنسجة باستخدام ملاقط معقمة. أيضا ، تخلص من الوسط المنهك وتجنب انفصال HASC عن طبق بتري.
اغسل الخلايا بعناية مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد إزالة برنامج تلفزيوني ، أضف ملليلتر واحد من التربسين الخالي من الحيوانات واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر الضوئي واحتضانها لمدة دقيقتين أخريين ، إذا لزم الأمر.
لدعم انفصال الخلية ، انقر برفق على السطح البلاستيكي. أوقف عمل التربسين بإضافة ملليلتر من الوسط الكامل وجمع كل الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلتر. إزالة التربسين المتبقية عن طريق الطرد المركزي.
بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل ونقل تعليق الخلية إلى قارورة T25 جديدة. للحفاظ على التبريد ، عد حصصة الخلايا المنفصلة المنفصلة باستخدام عداد الخلايا تحت المجهر الضوئي. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة خمس دقائق.
بعد التخلص من المادة الطافية ، الخلايا في مزيج التجميد بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر وانقل ملليلتر واحد من معلق الخلية إلى قنينة تبريد واحدة. ضع قوارير التبريد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في وعاء تجميد يقلل درجة الحرارة بمقدار درجة مئوية واحدة في الدقيقة ثم انقل قوارير التبريد إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. في المظهر العنقودي الأولي ، أظهرت HASCs شكلا كلاسيكيا يشبه المغزل وكانت أصغر حجما ، وكذلك أكثر استطالة مقارنة بخلايا التحكم في وجود FBS.
يبدو أن النمط المناعي للخلية متشابه بين HASCs المزروعة مع المكملين. كان أكثر من 80 إلى 90٪ من HASCs إيجابيا ل CD73 و CD105 وأقل من 5٪ تم التعبير عنه ل CD34 و CD45. أخيرا ، كشف اختبار الانتشار عن زيادة كبيرة في نمو الخلايا عند إضافة تحلل الصفائح الدموية البشرية إلى الوسط مقارنة بتحكم FBS.
الخطوة الأكثر أهمية هي التشريح الدقيق للشظايا الدهنية وربطها بشق مشرط على طبق بتري. يتم الحصول على مجموعة خلايا جذعية مشتقة من الدهون البشرية جاهزة للاستخدام فيما يتعلق بمعايير السلامة البيولوجية GMP ، والحفاظ على خصائص الخلايا العلاجية وتعزيز تكاثر الخلايا.
