لقد أنشأنا تقنية منصة ل SARS COVID 2 يمكن تطبيقها على الفيروسات الأخرى مع التعرف على الخلايا بوساطة Spike ودخولها كخطوة أولى في العدوى الفيروسية الخلوية. النقاط الكمومية مشرقة ومستقرة ويمكن تشغيل سطحها لمجموعة متنوعة من التطبيقات الخلوية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تصور وقياس استيعاب Spike في الخلايا.
لإعداد 0.1٪ BSA. أضف 130 ميكرولتر من 7.5٪ BSA إلى 10 ملليلتر من وسائط التصوير في مزيج. للحصول على تخفيف تسلسلي من 6.1 إلى ثلاثة وثلاثة أضعاف ، أضف 14.26 ميكرولتر من QD Spike إلى 285.74 ميكرولتر من 0.1٪ BSA لجعل أعلى تركيز من 20 نانومول.
ثم أضف 100 ميكرولتر من 20 نانومول أو QD Spike إلى 200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA لجعل الوهم الثاني من 6.67 نانومول QD Spike. قم بإزالة جميع الوسائط المستهلكة من كل بئر باستخدام شفاط متعدد القنوات ، واغسلها مرة واحدة باستخدام ماصة متعددة القنوات مع 100 ميكرولتر من وسائط التصوير لكل بئر ، ثم استطلع 100 ميكرولتر من وسائط التصوير. أضف 50 ميكرولتر من محلول QD Spike لكل بئر واحتضن الطبق لمدة ثلاث ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
ارتداء معدات الحماية ، وإعداد 4 ٪ PFA و 0.1 ٪ PSA وسائط التصوير داخل خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، وشفط 50 ميكرولتر من QD Spike من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من 4 ٪ PFA لكل بئر مع ماصة آلية متعددة القنوات لتجنب تجفيف الآبار. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ، وقم بإعداد الصبغة النووية الحمراء العميقة عن طريق تخفيف محلول مخزون الخمسة ملليمترات عند واحد إلى 1000 في PBS ، وشفط PBS وإضافة 50 ميكرولتر من الصبغة النووية المخففة لكل بئر. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ، أو صور اللوحة أو أغلقها باستخدام مانع تسرب اللوحة للتصوير لاحقا.
قم بتخزين اللوحة عند أربع درجات مئوية. بدء تشغيل البرنامج الخاص بمنصة التصوير. بعد تسجيل الدخول إلى منصة التصوير ، قم بإنشاء بروتوكول اكتساب جديد عن طريق تحديد نوع اللوحة كلوحة تصوير سفلية شفافة من 96 جدارا ، وحدد الوضع البصري وأصبح محوريا وتكبيره مثل غمر الماء 40 مرة ، وحدد binning كواحد.
حدد وضع تباينات الوجه الرقمي مثل التباين العالي لإنتاج أجسام خلايا محددة جيدا. التقط لقطة للتأكد من أن هذا العنوان مناسب كما هو موضح في نافذة الصورة، وحدد قناة C المناسبة للاستخدام مع خط خلية ACE2-GFP لتصور تهريب ACE2 داخل الخلية. لإنشاء قناة QD مخصصة ، حدد القائمة المنسدلة للمثلث واختر الإثارة في نطاق 405 نانومتر في الانبعاثات في نطاق 608 نانومتر ، وحدد بئرا بإشارة QD سيتوبلازمية قوية لضبط وقت التعرض وقوة الليزر وموضع ارتفاع Z.
تحقق مما إذا كان الارتفاع الافتراضي ينتج صورة للخلايا في المستوى البؤري المطلوب. سيكون موضع Z أقل بالنسبة للبونكتا الداخلية من موضع Z لغشاء البلازما. اختر وقت التعرض ، عادة ما بين 100 و 300 مللي ثانية ينتج صورة ساطعة بمستويات رمادية ، أكبر بثلاثة أضعاف على الأقل من إشارة الخلفية.
عند 20 نانومول ، يجب أن تكون المستويات الرمادية حوالي 6000 وحدة ذرية مع وقت تعرض 200 مللي ثانية وقوة ليزر 80٪. تحقق من المستويات الرمادية من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة المنتجة باستخدام ميزة اللقطة في كل قناة وتحديد كثافة العرض ، ثم انقر بزر الماوس الأيسر على الكائن محل الاهتمام أو الخلفية لعرض المستوى الرمادي لهذا البكسل ، واضبط طاقة الليزر لضبط شدة الكائنات ذات الاهتمام. احفظ بروتوكول الاكتساب ، وقم بالتبديل لتشغيل التجربة وأدخل اسم اللوحة ، وقم بتشغيل التجربة.
تم تصور نقل كل من QDs و ACE2 باستخدام المجهر الفلوري وخط الخلية ACE2-GFP. تم إجراء تجزئة الصور والتحليل اللاحق لاستخراج المعلمات ذات الصلة مثل عدد النقاط. أولا ، تم تقسيم النوى من قناة العلامة النووية لإنشاء مجموعة عائد على الاستثمار.
ثم منطقة عائد استثمار تحدد الخلية مع تقسيم باستخدام قناة ACE2-GFP. وأخيرا، تم تقسيم بقع QD 608 Spike من منطقة عائد الاستثمار الخلوي، وأظهرت إشارات QD و ACE2 الداخلية توطينا مشتركا قويا. تم إجراء تجربة استجابة التركيز مع ستة تركيزات مختلفة من QD Spike في خلايا HEK 293T.
لتحديد التركيزات البصرية ل QD ، يمكن استخدام QDS منخفضة تصل إلى 2.22 نانومول ، ومع ذلك ، فمن المستحسن استخدام تركيزات 10 نانومول أو أعلى لضمان استجابة قوية. أثناء الاقتران إلى تجميع بروتين QD قد يحدث. تم رصد المجاميع في محلول QD كراسبات متكتلة ساطعة وخلايا HEK 293T ، تم احتضان QDs بأجسام مضادة محايدة تبدأ من 30 ميكروغرام لكل ميكرولتر قبل إضافتها إلى الخلايا ، هذه الأجسام المضادة منعت الاستيعاب الداخلي وتسببت في انخفاض في عدد البقع مقارنة بالخلايا المعالجة ب QD فقط.
يمكن أيضا استخدام هذا المقال للفحص عالي الإنتاجية ، والتقييم الرئيسي للأجسام المضادة المحايدة لتحديد مضادات الفيروسات التورية إلى دخول الفيروس الكتلي وتكييفها لدراسة المتغيرات الناشئة حديثا.
