يصف بروتوكولنا كيف يمكن استخدام تقنيات مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي للمقايسات المنسدلة ، والطرد المركزي التحليلي الفائق ، ومقايسة مرافقة هيستون لتأكيد ما إذا كان البروتين هو مرافقة هيستون. يمكن تطبيق التقنيات التي يتم تناولها هنا ، عند استخدام الترادف ، مباشرة لتوصيف المرافق المفترض. يمكن أن يتماشى مع تقنية البيولوجيا الهيكلية.
التقنيات قابلة للتطبيق في مجال أبحاث الكروماتين. ومع ذلك ، يمكن تطبيق الطرق الفردية على أي بروتين آخر مهم ، حسب الحاجة. ومما يدل على الإجراء أن السيد سوراجيت غاندي ، طالب دكتوراه من مختبري ، من أجل الفحص المعقد للسحب ؛ السيدة.
أرشانا سامال ، طالبة دكتوراه ، جنبا إلى جنب مع السيد Ruchir C.Bobde لتجربة الطرد المركزي الفائق التحليلية ؛ السيد Somanath Baral ، طالب دكتوراه ؛ جنبا إلى جنب مع السيد Ketul Sahara لفحص البلازميد فائق اللف أولا ، امزج مرافقي هيستون خمسة ميكرومولار مع 20 ميكرومولار H2A / H2B dimers في 300 ميكرولتر من عازلة التوازن. جهاز طرد مركزي لمركب هيستون مرافقة H2A / H2B لإزالة أي راسب.
قم بتحميل العينة على عمود الدوران المتوازن مسبقا مع مخزن التوازن المؤقت. اغسل العمود ب 100 حجم عمود أو أربعة ملليلتر من محلول الغسيل لإزالة ديمر H2A / H2B الزائد. بعد ذلك ، امزج مركب هيستون مرافقة H2A / H2B مع 20 إلى 60 ميكرومولار H3 / H4 tetramer.
أعد غسل العمود ب 100 حجم عمود أو أربعة ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت لإزالة أي رباعي H3 / H4 غير منضم ، ثم قم بتخفيف العينات باستخدام محلول الشطف. إخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE. ثم ، وصمة عار مع Coomassie الأزرق اللامع R250 وتصور الجل.
تنقية H2A / H2B dimer ، H3 / H4 tetramer في مرافقة هيستون بشكل فردي مع عازلة غسيل الكلى باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي. احفظ المخزن المؤقت من المدى لإعداد المزيد من التخفيفات لاحقا واستخدامها كمرجع في خلية AUC. بالنسبة لعينات AUC ، امزج المرافقين المنقى مع dimer أو tetramer في أنابيب منفصلة إلى حجم نهائي يبلغ 450 ميكرولتر باستخدام مخزن غسيل الكلى المحفوظ للوصول إلى OD280 من 0.3 إلى 0.6.
قم بتجميع الخلية بقطعة مركزية مزدوجة القطاع ونوافذ كوارتز مزودة بجهاز طرد مركزي تحليلي فائق مع كاشف امتصاص. املأ 400 ميكرولتر من محلول العينة و 420 ميكرولترا من محلول غسيل الكلى في القطاعين المرجعي والعينة في الخلية ، على التوالي. قم بوزن الخلايا وموازنتها بدقة وتحميلها في دوار من التيتانيوم رباعي الثقوب.
قم بمحاذاة الخلايا باستخدام العلامات الموجودة أسفل الخلايا والدوار. قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، وابدأ التشغيل ، مما يسمح بتطور الفراغ واستقرار درجة الحرارة. لتحليل البيانات ، احسب الكثافة واللزوجة للمكونات العازلة للبروتينات والحجم المحدد الجزئي بناء على تكوين الأحماض الأمينية للبروتين باستخدام برنامج SEDNTERP.
قم بتحميل البيانات من جهاز AUC إلى برنامج SEDFIT. حدد الغضروف المفصلي والخط الأحمر وأسفل الخلية والخط الأزرق وحدود تحليل البيانات الخطوط الخضراء. اختر توزيع CS المستمر كنموذج.
في قسم المعلمات ، قم بتعيين الدقة القصوى حتى 100. بعد ذلك ، قم بتعيين معامل الترسيب كحد أدنى إلى الصفر والحد الأقصى إلى 10 إلى 15. اضبط نسبة الاحتكاك على 1.2 في البداية واختر التعويم لاشتقاق النسبة من البيانات.
اضبط نسبة F على 0.68 لتسوية سيجما واحدة. قم بتعيين الحجم المحدد الجزئي وكثافة المخزن المؤقت واللزوجة كما تم الحصول عليها من SEDNTURP. اضغط على Run للسماح للبرنامج بحل معادلة lam.
اضغط على Fit للتحسين. اختر إظهار Peak Mw في CS في وظيفة العرض لشريط الأدوات الرئيسي لتقدير الكتل الجزيئية. امزج رباعي H3 / H4 ثنائي الميكرومولار وأربعة ميكرومولار H2A / H2B dimer مع تركيزات متزايدة من مرافقة هيستون ، تتراوح من واحد إلى ستة ميكرومولار ، في مخزن مؤقت للتجميع إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر.
احتضان الخليط عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. في نفس الوقت ، قم بمعالجة 500 نانوجرام من بلازميد PUC-19 فائق الالتفاف سلبيا مع ميكروغرام واحد من إنزيم topoisomerase I في المخزن المؤقت للتجميع في حجم نهائي عند 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، ادمج المحلول المخلوط مسبقا الذي يحتوي على tetramer و dimer و histone chaperone مع الحمض النووي للبلازما المريح.
أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2X stop واحتضان لإنهاء تفاعل التجميع عن طريق إزالة البروتين من الحمض النووي البلازميد. أضف حجما متساويا من الفينول المشبع بالتريس في الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل واخلط محتويات خليط التفاعل جيدا. ثم ، الطرد المركزي العينة.
اجمع بلطف المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مع ماصة دقيقة وخلط حجم متساو من الكلوروفورم. دوامة الخليط. بعد ذلك ، اجمع المرحلة المائية العليا ، وأضف حجم 1/10 من أسيتات الصوديوم ثلاثية المولي من الرقم الهيدروجيني 5.5 ، و 2.5 حجم من الإيثانول المثلج.
امزج المحلول جيدا عن طريق قلب الأنبوب ثلاث إلى أربع مرات. جهاز طرد مركزي للعينة عند 16،200 جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية برفق. أبق الأنابيب مفتوحة في درجة حرارة الغرفة حتى تتبخر كميات ضئيلة من الإيثانول ، تاركة الحمض النووي البلازميد المترسب في الأنبوب.
كشفت نتائج SEC التحليلية أن مجال النيوكليوبلازمين الطرفي N المؤتلف لبروتين Arabidopsis thaliana FKBP53 هو خماسي من 65 كيلو دالتون في المحلول. أظهرت عينة النيوكليوبلازمين الخاضعة للمعالجة الحرارية أن المجال مستقر للغاية للحرارة. أظهر مجال نيوكليوبلازمين استقرار الملح حتى اثنين من أضراس كلوريد الصوديوم واستقرار اليوريا حتى أربعة أضراس.
كشف اختبار السحب لأسفل أن تفاعل مجال النيوكليوبلازمين مع H2A / H2B dimer كان مستقرا حتى 0.4 مولار كلوريد الصوديوم ، في حين أن الارتباط مع H3 / H4 كان مستقرا حتى 0.7 أضراس. يربط المرافق H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer في وقت واحد ، بغض النظر عن الترتيب الذي يتم إضافتهما به إلى المرافق ، مما يشير إلى مواقع تفاعل منفصلة ل oligomers. تكشف الكتل الجزيئية المقدرة من خلال AUC-SV عن قياس متكافئ 1: 1 لمجال النيوكليوبلازمين مع أوليغومرات هيستون.
في مقايسة البلازميد فائقة اللف ، زاد مرافقو هيستون النبات المؤتلف AtNRP1 و AtNRP2 من كمية البلازميد فائق الالتفاف ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يودع الهستونات على الحمض النووي لتكوين النيوكليوسومات ، مما يتسبب في التفاف الحمض النووي الفائق. يحتاج فحص البلازميد فائق اللف إلى عناية خاصة وتحسين ممكن لتوصيف الحمض النووي للهيستون وتوصيف المرافق. يمكن استخدام القياس عن بعد للتوصيف الأيزوميري كمتابعة لتجارب استبعاد الحجم التحليلية لتأكيد استقرار الربط.
