نظرا لتعقيد التفاعلات في كل مكان و deubiquitquitination داخل الخلايا من المهم إنشاء في المختبر مع مكونات تنقية محددة. وهذا يساعد على فهم آليات في كل مكان و deubiquitquitination وأيضا لتحديد كيفية الطفرات المرتبطة الجينات التي ترميز الإنزيمات المسؤولة عن هذا التفاعل يمكن أن يسبب المرض البشري. يمكننا تحديد المجالات والزخارف في هذه المكونات التي تحرك هذه التفاعلات.
يمكننا أيضا تطوير عالية الإنتاجية الشاشة المقايسة التي يمكن استخدامها لفحص لمثبطات جزيء الصغيرة التي يمكن تطويرها والعلاجات المحتملة. لبدء تحلل البكتيريا، إضافة PMSF وكوكتيل مضاد للبروتين في الجليد الباردة تحلل العازلة A.Add 25 ملليلتر من العازلة تحلل A في زجاجة تحتوي على بيليه البكتيريا و resuspend بيليه. نقل البكتيريا التي تحتوي على lysate في أنبوب ل sonication.
استخدام سونيكاتور التحقيق ل sonicate lysate في 70 ٪ سعة الانتاج لمدة 30 ثانية ، أربع إلى خمس مرات. ثم الطرد المركزي في 21،000 مرات ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد احتضان البكتيريا مع خرز GSH لمدة خمس ساعات وفقا للمخطوطة، نقل الخرز جنبا إلى جنب مع 10 ملليلترات من العازلة في عمود الكروماتوغرافيا فارغة.
ثم، إضافة 1.5 ملليلتر من العازلة A التي تحتوي على الجلوتاثيون ملليمولار 25 في العمود وجمع elution عن طريق الجاذبية في 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة. كرر إجراء الاستماء أربع مرات مع العازلة الطازجة A استمرار معالجة الكسور المائلة وفقا للمخطوطة. للبدء، resuspend له-BAP1 والكريات البكتيريا MBP-DEUBAD في 25 ملليلتر من الجليد الباردة تحلل العازلة B.Mix 25 ملليلتر من كل lysate واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
سونيكات ومن ثم الطرد المركزي في 21، 000 ز مرات لمدة 20 دقيقة. بعد الطرد المركزي lysate، تصفية lysate من خلال 0.45 ميكرومتر مسام محاقن فلتر في زجاجة ومزجها مع حبات NTA نيكل. احتضان في أربع درجات مئوية مع اهتزاز لمدة خمس ساعات.
بعد ذلك، تدور أسفل الخرز في 25،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. استخدام ماصة لحفظ عظمى في أنبوب 50 ملليلتر كما تدفق من خلال. غسل الخرز مع خمسة ملليلترات من العازلة B، التي تحتوي على imidazole 20 ملليمولار، ست مرات مع جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق.
بعد الغسيل الأخير، نقل الخرز مع 10 ملليلترات من المخزن المؤقت B إلى عمود كروماتوغرافي فارغ وإضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت B الذي يحتوي على إيميدازول 200 ملليمولار. جمع elution عن طريق الجاذبية في 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على DTT وEDTA. كرر إجراء elution أربع مرات وتجمع الكسور المائل المطلوبة في أنبوب 15 ملليلتر.
إضافة العازلة جيم لتخفيف مجمع مائل ثلاث مرات. ثم نقل elution المخفف إلى الخرز amylose المعدة في الأنابيب واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع اهتزاز. في الصباح، الطرد المركزي الأنابيب في 2،500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق والحفاظ على supernatant في أنبوب 15 ملليلتر كما تدفق من خلال.
غسل البروتين ملزمة الخرز مع خمسة ملليلتر من العازلة C لمدة خمس إلى ست مرات. ثم إضافة 500 ميكروليتر من العازلة D إلى تطهيرها له BAP1/ MBP-DEUBAD مجمع على الخرز agarose amylose لجعل حل حبة 50٪. نقل 20 ميكرولترات من 50٪ حبة الحل إلى أنبوب microcentrifuge وإضافة 20 ميكرولترس من مرتين Laemmli عينة العازلة لSDS-PAGE وتحليل الأزرق Coomassie.
تخزين الحل الخرز المتبقية في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. بعد الثقافة خلايا HEK293T، لوحة 12 مليون خلية في 20 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة في طبق ثقافة 15 سنتيمترا، قبل يوم واحد من transfection. بعد يوم واحد واحد، تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، ووسائط الاستنشاق وإمدادات مع 12 ملليلتر من وسائل الإعلام الحرة المصل.
Transfect الخلايا مع 21 ميكروغرام من pCDNA شقة H2A باستخدام 63 ميكرولتر من PEI في مليغرام واحد لكل ملليلتر. بعد 12 ساعة، قم بالتغيير إلى متوسطة كاملة. بعد حصاد الخلايا وفقا للمخطوطة، resuspend بيليه الخلية في حوالي 10 مجلدات من العازلة E التي تحتوي على NEM لمنع deubiquiticeinases وأنت احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
بعد الطرد المركزي في 3، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق، والتخلص من عظمى. غسل الكرومات بيليه مرتين مع 10 كميات من العازلة E أولا ثم غسل مرتين مع F.Resuspend العازلة الكروماتين في خمسة ملليلتر من العازلة F وعلاج بيليه مع النوى الدقيقة في تركيز ثلاث وحدات لكل ملليلتر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، نقل 40 ميكرولتر aliquot من الخليط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لتحليل شظايا الحمض النووي النووي.
إضافة 40 ميكرولترات من الفينول الكلوروفورم و 20 ميكرولترات من ست مرات الحمض النووي تحميل العازلة. دوامة وتدور في 18،000 مرات ز لمدة دقيقتين. ثم نقل 15 ميكرولترات من المرحلة مائي في هلام agarose 2٪لتحميل الحمض النووي.
بعد إيقاف التفاعل والطرد المركزي وفقًا للمخطوطة ، احتضن جزء الكروماتين القابل للذوبان مع حبات راتنج مضادة للعلم في أنبوب 15 ملليلتر بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع اهتزاز. غسل الخرز ست مرات مع G.Transfer العازلة مع خمس ملليلترات من العازلة G في عمود الكروماتوغرافيا فارغة. تمييع النوى المقيدة للخرزة مع 260 ميكرولترات من العازل G تحتوي على 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من ببتيد elution العلم وواحد إلى خمسة واحد من الدارس تريس في الثامنة من رقم ه.
إلوت النوكلوزومات ثلاث مرات، ساعة واحدة في الغرفة الباردة. لأداء تحليل في كل مكان، أولا إضافة ميكروغرام واحد من النيوكلوزومات المنقية في 40 ميكرولترات من H.بعد ذلك العازلة H.After ذلك، إضافة مزيج حل انزيم يحتوي على 250 نانوغرام من UBE1، 672 نانوغرام من UB و E2 UB الاقتران الإنزيمات وميكروغرام واحد من BMI1-RING1B E3 ubiquitin مجمع ليغا في الأنبوب. احتضان رد الفعل لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في بعض الأحيان.
وقف رد الفعل عن طريق إضافة 40 ميكرولتررس من مرتين Laemmli عينة العازلة وتحليل histone H2AK119 في كل مكان من قبل النشاف الغربية. لأداء في المختبر deubiquitquitination فحص resuspend النيوكلوزومات النقية في 40 ميكرولترات من العازلة الأولى وميكروم واحد من البكتيريا تنقية له BAP1 / MBP - DEUBAD الخرز. وضع أنبوب في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات لتنفيذ رد فعل deubiquitination مع اهتزاز في بعض الأحيان.
ثم وقف رد الفعل عن طريق إضافة 40 ميكرولترات من مرتين Laemmli العازلة وتحليلها عن طريق المناعة. في هذه التجربة، يُظهر التلطيخ الأزرق Coomassie لتنقية نموذجية لمجمع GST-BM1-RING1B باستخدام حبات تقارب GST، أن العصابات تهاجر في الوزن الضروس المتوقع حول 45 كيلودالتون و 13 كيلودالتون على التوالي. وبالمثل، أدى تنقية مجمع ه-BAP1 MBP-DEUBAD أيضا إلى استعدادات متجانسة عالية نسبيا مع عصابات حول 90 كيلودالتون و 55 كيلودالتون على التوالي.
من ناحية أخرى يتكون الكسر النوى المنقى أساسا من قبل 147 قاعدة زوج الفرقة مما يدل على وجود نسبة عالية من الكسور أحادية النواة. Coomassie الأزرق تلطيخ من النيوكلوزومات المنقى يظهر نمط الفرقة نموذجية من الوحدات الفرعية الأربعة ذات الحجر الهحي مع كميات stoichiometric. يظهر Ubiquitination من H2A histone مع مجمع BMI1-RING1B زيادة الوقت تعتمد على شكل في كل مكان من البروتين في حين أن مستويات النموذج غير المعدلة تنخفض في وقت ومتزامنة.
رد فعل في كل مكان هو مجموع كما يتم تحويل جميع البروتينات H2A تقريبا إلى H2A K119ub. من ناحية أخرى، أجريت فحص إزالة ubiubiquitination النويوزومات الأصلية. بعد حضانة هذه النيوكلوزومات مع BAP1-DEUBAD تم ملاحظة الحد من الوقت المعتمدة من إشارة H2A K119ub.
يعتمد نجاح التفاعلات في كل مكان والفك على الطريقة التي يتم بها تنقية البروتين. نحن بحاجة إلى عائد جيد واستخدام العازلة لإعادة تركيب البروتين وتنقيته يجب أن تكون متوافقة مع التفاعلات الكيميائية الحيوية. عندما تكون هذه الفحوصات في كل مكان و deubiquitquitination راسخة يمكننا اختبار المنشطات المؤثرة والمثبطات وكذلك تأثير الطفرات الجينية المرتبطة بالمرض.
وقد تم إنشاء هذه الطريقة من خلال مساهمة العديد من المختبرات وهي مفيدة جدا لفهم آليات في كل مكان و deubiquitquitination. العديد من المواد الكيميائية خطرة وتحتاج إلى أن يتم التلاعب بها في غطاء محرك السيارة. وهذا يشمل الفينول الكلوروفورم والأحماض والقواعد، والحد من العوامل.
