يعد توصيف التعبير الجيني على المستوى النسخي أمرا أساسيا لفهم وظيفة الخلية في الصحة والمرض. تركز طريقتنا على التقاط الخلايا البطانية ، وهي الطبقة الحاسمة من جدار الأوعية الدموية ، من الشرايين المينستيرية للمتبرعين البشريين للتنميط النسخي بدقة أحادية الخلية ومكانية. هناك مجموعة غنية من الخلايا البطانية من وعاء دون خطوة فرز ، والتي يمكن أن تسبب فقدان الخلايا.
علاوة على ذلك ، توجد أنواع أخرى من الخلايا تسمح بالتحقيق في تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق الأنسجة. لقد استخدمنا هذه التقنية للتحقيق في التغيرات الشريانية في مرض السكري والسمنة. اعتمادا على توافر السفينة ، يمكن أيضا إعادة استخدام هذه التقنيات لاستكشاف البيولوجيا في الأوعية الدموية الأخرى والأمراض الأخرى.
إذا كانت هذه هي المرة الأولى ، فإن خطوتين رئيسيتين تتطلبان أكبر قدر من الممارسة. أولا، الكشط، على الرغم من أنه ينبغي بذل القوة الكافية لإزالة الخلايا المتكاملة دون فصل الطبقات الأعمق. والثاني ، تقسيم cryostat.
تأكد من أن الأقسام باردة ومسطحة وداخل حدود الشريحة المتخصصة. سيوضح الإجراء Yingjun Luo و Xiaofang Tang ، وهما باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبري. لبدء غسل الأنسجة مع DPBS.
باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح ، قم بإزالة الدهون والأنسجة الضامة الخارجية حتى يصبح الوعاء نظيفا. قم بقياس طول الوعاء باستخدام مسطرة موضوعة خارج الطبق والتقط سجلات فوتوغرافية. قطع الشريان المساريقي بالطول باستخدام مقص لفتح تجويف الوعاء عموديا.
باستخدام الإبر ، قم بتوصيل الوعاء بالشمع الأسود في جميع الزوايا الأربع ، مما يعرض العلاقة الحميمة. أضف ملليلتر واحد من مخزن الهضم العازل المسخن مسبقا إلى العلاقة الحميمة. باستخدام مشرط معقم ، كشط بلطف تجويف الوعاء مرتين.
انقل المخزن المؤقت للهضم إلى أنبوب. أضف ملليلتر واحد من مخزن الهضم المؤقت إلى intima وماصة لأعلى ولأسفل بعناية لجمع الخلايا المتبقية ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في حاضنة أو على هزاز.
أضف وسط M199 إلى تعليق الخلية لإخماد التفاعل الأنزيمي واخلطه بلطف. قم بالطرد المركزي للتعليق لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية و 600 مرة G.At نهاية جهاز الطرد المركزي ، وقم بإزالة وتخزين المادة الفائقة بشكل منفصل كثقافة تحكم لمراقبة ما إذا كانت جميع الخلايا قد تم التقاطها في الكريات. ثم ، أعد تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من وسط M199.
تقييم جدوى الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولترات من التربان الأزرق مع 10 ميكرولتر من مخزون الخلايا. راقب مورفولوجيا الخلية وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بتغطية بئرين من صفيحة من ستة آبار عن طريق سحب 500 ميكرولتر من كاشف التعلق في الآبار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد غسل الآبار باستخدام DPBS المعقم ، قم بتوزيع مخزون الخلايا الكامل في بئر واحد ، ويتم الاحتفاظ بالمادة الفائقة كعنصر تحكم في البئر الثاني. جهاز الطرد المركزي أعد مسبقا مخزون الخلايا عند أربع درجات مئوية و 600 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات بلطف باستخدام ماصة P-1000 في 0.04٪ BSA في DPBS.
اخلطي جيدا لضمان تعليق أحادي الخلية. مرر المحلول من خلال مصفاة 40 ميكرومتر لإزالة حطام الخلايا. ثم ، الطرد المركزي للتعليق وإزالة supernatant كما هو موضح.
أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في DPBS باستخدام ماصة P-1000 واخلطها جيدا لضمان تعليق خلية واحدة. كما هو موضح سابقا ، قم بتقييم صلاحية الخلية باستخدام أزرق التربان. باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي ، راقب مورفولوجيا تعليق الخلية الواحدة ، وتحقق من وجود حطام الأنسجة ، واحسب عدد الخلايا الحية والميتة.
بعد إضافة الأيزوبنتان إلى علبة معدنية، قم بتبريده في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف. صب مركب OCT في آبار من قالب التبريد البلاستيكي المسمى ، ومنع تكوين فقاعة. اترك قالب التبريد على الثلج الجاف ليبرد.
قطع ما لا يقل عن قسمين إكليليين من سنتيمتر واحد في طول السفينة. باستخدام ملقط 12 بوصة ، غمر الأنسجة في الأيزوبنتان حتى يتم تجميدها. قم بغمر الأنسجة بسرعة في OCT عند التوجيه مع التجويف المرئي في المركز.
أمسك قوالب التبريد وضعها على الثلج الجاف وراقب التجميد. سيصبح OCT أبيض تدريجيا من الخارج في غضون دقيقة إلى دقيقتين. قم بتخزين هذه الأقسام في حاوية آمنة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ستة أشهر.
قم بإعداد درجة حرارة cryostat المطلوبة للغرفة ورأس العينة. قم بموازنة مقاطع الأوعية والسكاكين والفرش والشرائح المضمنة في OCT إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر في cryostat لمدة 30 دقيقة تقريبا. أثناء التوازن ، قم بتنظيف الماكينة وجميع المعدات التي قد تلمس الأقسام ، بما في ذلك الشفرة ، باستخدام 70٪ من الإيثانول متبوعا بمحلول إزالة التلوث RNase.
قم بإرفاق العينة عن طريق توزيع كمية صغيرة من OCT على كتلة cryostat الدائرية ووضع العينة في الأعلى قبل أن تتجمد. بعد وضع الكتلة في وسط رأس العينة ، قم بتثبيت الكتلة في مكانها باستخدام المقبض الأسود الطويل على اليسار. قطع أي OCT الزائدة المحيطة السفينة.
ضبط سمك القطع على 10 ميكرومتر على المبرد ، وقطع ما يقرب من 60 قسما ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا يحتوي على كاشف استخراج الحمض النووي الريبي. دوامة حتى يتم حل الأقسام تماما. استخراج الحمض النووي الريبي كما هو موضح في مخطوطة النص وإذابة بيليه الحمض النووي الريبي النقي في خمسة ميكرولترات من الماء الخالي من RNase.
قطع أقسام سميكة 10 ميكرومتر مع لوحة مضادة للتدحرج في مكانها. اقلب وقم بتسطيحه بعناية عن طريق لمس القسم بلطف من خلال OCT المحيط. امسح الشريحة بالإيثانول وقم بتسخين الجانب الخلفي من منطقة الالتقاط مسبقا بإصبعك.
باستخدام فرش cryostat الخالية من RNase أو الشريحة مباشرة ، ضع قسم الأنسجة داخل المربع باستخدام OCT المحيط فقط. بمجرد أن يلتصق القسم، ضع الشريحة على شريط التبريد للسماح للقسم بالتجمد.
قطع أقسام الأنسجة التي يبلغ سمكها 10 ميكرومتر كما هو موضح سابقا على شرائح تحسين الأنسجة أو التعبير الجيني. انقل الشريحة إلى بريدية شرائح موضوعة على الثلج الجاف. يصور الشكل ECs المعزولة المستزرعة باستخدام البروتوكول الموصوف الذي يعرض مورفولوجيا مميزة تشبه الحصى مع الحد الأدنى من الخلايا الملوثة.
تم تأكيد التعبير عن الكادهيرين البطاني الوعائي لعلامة EC باستخدام التألق المناعي الذي يصور التقاطعات من خلية إلى خلية. كان ما يقرب من 80٪ من الخلايا إيجابية CD31 ، مما يشير إلى أن ECs الشريانية المساريقية البشرية تشكل معظم مجموعة الخلايا المعزولة حديثا. تؤدي عمليات العزل غير الناجحة إلى خلايا ذات مورفولوجيا مضطربة ، يحتمل أن تعبر عن علامات اللحمة المتوسطة أو استطالة تشبه حالة الأرومة الليفية.
ويبين الشكل تقريب وإسقاط تمثيلي موحد متعدد معزول للشريان المساريقي باستخدام البروتوكول الحالي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية على ECS الشرياني المساريقي البشري المعزول، مع تجميع 34٪ من الخلايا على شكل ECs باستخدام PECAM1 و VWF كعلامات. يجب أن يظهر الحمض النووي الريبوسومي ذو الجودة العالية رقم سلامة الحمض النووي الريبوسومي لا يقل عن ستة ، ونسبة نطاقات الحمض النووي الريبوسومي الريبوسومي 28S إلى 18S قريبة من اثنين قدر الإمكان. يمكن ملاحظة ضعف أو غياب إشارات الحمض النووي الريبوسومي هذه عند تحلل الحمض النووي الريبي.
تصور تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين مورفولوجيا السفينة ، مما يسمح بتحديد المناطق ذات الأهمية. تم تصور التعبير الجيني مع التثبيت المكاني على الوعاء الملطخ بالهيماتوكسيلين والإيوزين. تعامل مع مخزون الأنسجة والخلايا بعناية للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي ، خاصة بالنسبة للتنميط المكاني.
تأكد من وضع الأنسجة على الثلج الجاف للحد من تدهور الحمض النووي الريبي. أيضا ، تعامل مع الأقسام والأنسجة باستخدام أدوات مبردة مسبقا. لقد تمكنا من استكشاف تغيرات التعبير الجيني EC ، بما في ذلك LncRNAs في سياق مرض السكري وتفاعلها مع أنواع الخلايا الأخرى.
يمكننا استنتاج موقع هذه التغييرات النسخية باستخدام تقنيات التنميط المكاني.
