Name: isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells
Uploaded: 2015-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

يتم تنفيذ بروتوكول التالية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها إدارة مختبر طب الحيوان في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل. 1. إعداد المواد التالية والكواشف قبل بدء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد EC وسائل الإعلام من خلال استكمال 400 مل انخفاض مستوى السكر (1 جم / لتر D-الجلوكوز أو LG) Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 50 مل للحرارة المعطل مصل بقري جنيني، 50 مل نو-المصل IV، 5 مل مضاد حيوي، مضاد فطري، وhFGF، VEGF، hEGF، R3، IGF-1، ومكونات الهيبارين من عدة التجارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل FACS العازلة (0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني)؛ من خلال تصفية العقيمة 0.22 ميكرون تصفية الكأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم أو تطهير تشريح متنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم دبابيس تشريح، مقص جراحي، وdissectors. </li></ol> 2. EC عزل (يوم 1 ~ 5 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفأر مع ثاني أكسيد الكربون أو وسائل أخرى الطرافة المتوافقةح لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) السياسات. ملاحظة: أورام الثدي متعددة متفاوتة في الحجم (5-15 ملم في القطر) قد وضع في ماوس واحدة المعدلة وراثيا مثل C3-TAG، ومن المؤكد أن يحصد كل منهما لTEC العزلة. في حالة استخدام الأورام التي يتم المغروسة orthotopically في الفئران، تجمع 02:58 1 سم 3 أورام لعزل EC واحدة. هنا نستخدم الأورام الثديية كدليل، ولكن يمكن تعديل البروتوكول لأنواع أخرى من الأورام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الماوس عن طريق الرش أو مسح الجانب البطني الفأر مع كمية وافرة من 75٪ ت / ت الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بتر الأورام مع زوج واحد من مقص وdissectors باستخدام تقنيات العقيم في غطاء العقيمة أو على مقاعد البدلاء نظيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مد ويعلقون أطرافه من الفئران على لوحة تشريح. جعل شق بطني خط الوسط مع مقص دون فتح الغشاء البريتوني. تشريح أفقيا بين الجلد والصفاق نحو الغدد الثديية حيث توجد الأورام.لا تفتح الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكوس فقط الأنسجة السرطانية من الغدد الثديية، تاركة هوامش الثديية العادية. تقليم بعناية من الأنسجة غير السرطانية مثل الجلد والعضلات، ومكان الأورام تشريح في أنبوب مخروطي يحتوي على 30 مل من LG-DMEM على الجليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب عينات الورم لغطاء نسيج الثقافة. غسل الأنسجة مع معقم LG-DMEM 1-2 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأورام نقل من أنبوب مخروطي إلى الأنسجة الثقافة طبق بتري معقمة، إضافة 2 مل من LG-DMEM في الطبق، واللحم المفروم مع زوج من مقص العقيمة إلى قطع &lt;5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من كولاجيناز (الأسهم = 2 ملغ / مل في محلول الملح المتوازن هانك، الآخرة HBSS)، 1 مل من dispase (الأسهم = 2.5 U / مل في HBSS) و 75 ميكرولتر من ديوكسي ريبونيوكلياز (الأسهم = 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني ) في طبق بتري. الحجم الكلي هو حاليا ~ 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مزيج كولاجيناز / الأنسجة من طبق بتري لأنبوب الأنسجة dissociator وتعمل على dissociator الأنسجة لمدة 60 ثانية مرتين (قبل مجموعة تفكك العلاقات العامةogram على dissociator: 1270 إجمالي طلقة في المدى). احتضان مع الضوء تهتز على شاكر لمدة 75 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح هضمها الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون أكثر من 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تصفية شطف مع 5 مل من العازلة FACS لغسل أي الخلايا المتبقية. تدور في 280 x ج لمدة 5 دقائق ونضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1 مل من الأسهم RBC العازلة تحلل (10X) في 9 مل من الماء المعقم. ليز خلايا الدم الحمراء مع 10 مل من تحلل العازلة (1X)، وعلى الفور تدور 5 دقائق في 280 ز س. ملاحظة: هذه الخطوة يمكن تخطي إذا الدم القليل مرئيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في 10 مل من العازلة FACS. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق زنزانة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق، وعدد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا resuspend في ~ 10 7 خلية / 100 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولتر من كتلة FCR لكل 100 ميكرولتر من التعليق الخلية، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الفئران مكافحة الماوس مترافق PE-CD31 الأجسام المضادة وفقا. إلى الجدول 1 احتضان على الجليد لمدة 10 - 15 دقيقة وأنبوب نفض الغبار في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من العازلة FACS إلى أنبوب وتدور في 280 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية طاف، ويغسل بيليه الخلايا مرة أخرى مع 5 مل من العازلة FACS. أجهزة الطرد المركزي لتكوير الخلايا. نضح طاف دون بيليه خلية مثير للقلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة FACS العازلة والمضادة للPE بلي وفقا للجدول 2 احتضان على الجليد لمدة 10 - 15 دقيقة. نفض الغبار الأنبوب في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من العازلة وتدور عينات FACS في 280 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرة واحدة مع 5 مل من FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. نضح طاف دون بيليه مثير للقلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق وحدة التخزين إلى 300 ميكرولتر في المخزن FACS. تدور خلال 35 ميكرون خلية مصفاة توج أنبوب 5 دقائق في 280 ز س. 2 استخدام الأنابيب وحجم أكبر إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء multistand المغناطيسي والأعمدة المغناطيسي في غطاء محرك السيارة، ونعلق عمود إلى فاصل وتتوازن مع العمود 2 مل من العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspiratالبريد طاف و resuspend بيليه خلية في 0،5-1 مل من العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير تعليق الخلية من خلال العمود المغناطيسي معايرتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود ثلاث مرات مع 2 مل العازلة FACS، وجمع التدفق من خلال (FT) في أنبوب 15 مل (FT جزء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ العمود قبالة فاصل وأزل مع 2 مل العازلة FACS إلى 15 مل أنبوب (جزء الشطافة) آخر. استخدام المكبس لضمان أن جميع الخلايا من العمود. تكرار شطف مرتين أخريين مع 2 مل من FACS العازلة في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور شطافة في 280 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه في 10 مل من EC سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم بالتساوي جزء الشطافة (~ 6 مل) في 10 سم أطباق الجيلاتين المغلفة. لمدة ثلاثة 1 سم 3 الأورام، لوحة مزال الخلايا في أربعة على الأقل لوحات. الخلايا بدلا من ذلك، لوحة مزال بتركيزات مختلفة في لوحات متعددة (على سبيل المثال، البذور 0.5 مل، 1 لتر، 1.5 لتر، و 3 مل من شطافة إلى أربع لوحات) لضمان أنوالمصنف لوحة ر الأقل واحد قليلة مع خلايا مزال. تأكد من أن confluency من الخلايا المرفقة في ~ 1٪ في اليوم التالي (أي حوالي 1،0-2،0 X 10 5 خلايا المرفقة). ملاحظة: تحتاج هذه الخلايا لتكون مطلية متفرق بحيث المستعمرات EC يمكن أن تشكل دون الملوثة أنواع الخلايا الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة FT جزء واحد في صحن 10 سم للسماح للخلايا التعافي O / N. تأكد من أن لوحة هي 80-100٪ متموجة في اليوم التالي. تجميد أسفل الخلايا (-80 ° C) في 250 وسائل الاعلام تجميد الخلايا ميكرولتر في cryotube وتخزينها في النيتروجين السائل في اليوم التالي. ملاحظة: FT جزء يمكن استخدامها لعزل الخلايا السرطانية في مرحلة لاحقة و / أو كعنصر تحكم السلبية لتحليل EC التعبير الجيني من الحيوانات المستنسخة EC معزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. المستعمرات تبدأ بتشكيل بعد 7-10 أيام. يمكن التعرف على المستعمرات EC صغيرة في وقت مبكر من يوم 3. كافة المستعمرات مع علامة غرامة طرف على الجزء السفلي من الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط ج غير محددةملتعلمي اللغة اإلنكليزية المحيطة المستعمرات التي تم تحديدها مع العقيمة 200 ميكرولتر pippet طرف. </li></ol> 3. مستعمرة اختيار خواتم عن طريق الاستنساخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. EC نقاء يمكن فحصها من قبل LDL (الجاذبة-AC-LDL) بالإضافة إلى حوالي 5-7 أيام. إضافة 50 ميكرولتر من LDL في 10 مل EC المتوسطة واحتضان لمدة 3-4 ساعة قبل فحص الخلايا تحت المجهر مضان. ملاحظة: يمكن ملاحظة LDL متعددة + استنساخ EC في ~ يوم 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء حصاد المستعمرات EC عندما تصل أقطارها من 3-5 ملم في الحجم. (اختر المستعمرات الكبيرة التي تكتظ LDL + خلايا صغيرة حصول على أفضل النتائج.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل حصاد EC مع حلقات الاستنساخ، قبل معطف بضع 6 لوحات جيدا مع 0.5٪ الجيلاتين. نضح الجيلاتين، إضافة 2 مل من EC وسائل الإعلام إلى كل بئر، والحفاظ على لوحات في حاضنة لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط غير EC-على حواف المستعمرات للتأكد من سيسقطون أي أنواع الخلايا الأخرى داخل الحلبة الاستنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدامالمجهر على النقيض من المرحلة (4X أو 10X الهدف)، الخطوط العريضة مع علامة غرامة طرف على الجزء السفلي من الطبق ثقافة المناطق التي تحتوي على المستعمرات EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وترك طبقة رقيقة جدا من برنامج تلفزيوني في لوحة عندما الشفط. (هام: كمية صغيرة (~ 0.5 مل) من برنامج تلفزيوني سوف تبقي الخلايا على قيد الحياة أثناء إجراء الاستنساخ الدائري، كما لاصقة الأنسجة يحتاج إلى الماء لالسندات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار خاتم استنساخ الحجم المناسب. استخدام زوج من ملقط تشريح لالتقاط حلقة، مع وجود طرف الماصة 10 ميكرولتر تطبيق بالتساوي كمية صغيرة من مادة لاصقة الأنسجة على عصابة الاستنساخ. ملاحظة: استخدام كمية ضئيلة فقط (~ 0.2 ميكرولتر لحلقة صغيرة) من مادة لاصقة الأنسجة على حلقات الاستنساخ، وجعل ينتشر على يقين من لاصق الأنسجة بشكل متساو في جميع أنحاء السطح السفلي لضمان ختم جيدة. لاصق الأنسجة المفرط تنتج الحرارة ويشكل الأفلام التي قد تقتل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع حلقة الاستنساخ على المستعمرة EC. اضغط بلطف إلى أسفل الحلبة الاستنساخ لالغراء رينانوغرام على طبق. تأكد من أن المستعمرات لا جفت قبل الإلتصاق الحلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة على الفور 25 ميكرولتر من الأنزيمي حل انفصال الخلايا في حلقة الاستنساخ واحتضان ~ 1 دقيقة أو حتى يتم إرفاق خلايا فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا الماصة في حلقة الاستنساخ قطرة من الحكمة في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الإعلام EC قبل تحسنت. (هام: لا يهز لوحة لتفريق الخلايا وEC يفضل أن تنمو في مجموعات ضيقة.) اغسل حلقة الاستنساخ مع 50-100 سائل الإعلام EC ميكرولتر لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا وقت ممكن، ونقل جميع يغسل في نفس 6 جيدا . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وإذا كان بعض المستعمرات في صحن 10 سم صغيرة جدا لموسم الحصاد، إضافة 10 مل وسائل الإعلام الجديدة، والسماح للمستعمرات تنمو لبضعة أيام، وكرر الإجراء حلقة الاستنساخ مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو المستعمرات التي تحصد في 6 لوحات جيدا حتى 80-100٪ متموجة، ونقل الخلايا إلى 3 آبار لوحة 6 جيدا، قبل توسيعها في صحن 10 سم زراعة الأنسجة. كشط الخلايا الملوثة. تكررجولة أخرى من إجراءات حلقة الاستنساخ (الخطوات 3،5 حتي 3،10) إذا لزم الأمر. حفاظ على الخلايا متموجة نسبيا (~ 60-70٪) عند التوسع. EC قد تتوقف عن النمو إذا مطلي متفرق جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز EC قبل FACS، وتلطيخ، PCR، وما إلى ذلك لاحظ أن ديل-AC-LDL هو فلوري وربما يتعارض مع PE أو الأجسام المضادة فلوري أخرى للFACS. </li></ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis:+new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors.</a> Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructive+role+of+the+vascular+niche+in+promoting+tumour+growth+and+tissue+repair+by+angiocrine+factors.">Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).</li><li>Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+endothelial+cells+directly+influence+cancer+progression.">Stromal endothelial cells directly influence cancer progression.</a> Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Beck, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+niche+and+a+VEGF-Nrp1+loop+regulate+the+initiation+and+stemness+of+skin+tumours.">A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours.</a> Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).</li><li>Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells.">Tumor endothelial cells.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+tumor+endothelium.">Molecular heterogeneity of tumor endothelium.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).</li><li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein.">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li><li>Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stable+molecular+signature+in+mammary+tumor+endothelial+cells+that+persists+in+vitro.">Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro.</a> Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).</li><li>Beijnum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+tumor+angiogenesis+dissected:+specific+targeting+of+colon+cancer+angiogenic+vasculature.">Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature.</a> Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).</li><li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+angiogenesis:+from+microscope+to+clinic.">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).</li><li>Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+abnormalities+of+blood+vessels+as+targets+in+cancer.">Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer.</a> Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).</li><li>Ghosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+endothelial+cells+exhibit+aberrant+Rho-mediated+mechanosensing+and+abnormal+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).</li><li>Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+express+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+but+not+ErbB3+and+are+responsive+to+EGF+and+to+EGFR+kinase+inhibitors.">Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors.</a> Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).</li><li>Hida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+endothelial+cells+with+cytogenetic+abnormalities.">Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities.</a> Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).</li><li>Dudley, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcification+of+multipotent+prostate+tumor+endothelium.">Calcification of multipotent prostate tumor endothelium.</a> Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).</li><li>Dunleavey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+channels+formed+by+subpopulations+of+PECAM1(+)+melanoma+cells.">Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells.</a> Nat. Comm. 5, 5200 (2014).</li><li>St Croix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+human+tumor+endothelium.">Genes expressed in human tumor endothelium.</a> Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).</li><li>Bhati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+breast+tumor+vascular+cells.">Molecular characterization of human breast tumor vascular cells.</a> Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).</li><li>Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CYP24+in+the+tumor+microenvironment.">Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+differences+between+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries+revealed+by+microarray+analysis.">In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).</li><li>Ginsberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+direct+reprogramming+of+mature+amniotic+cells+into+endothelial+cells+by+ETS+factors+and+TGF&#946;+suppression.">Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGF&#946; suppression.</a> Cell. 151 (3), 559-575 (2012).</li><li>Sapino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD31+by+cells+of+extensive+ductal+in+situ+and+invasive+carcinomas+of+the+breast.">Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast.</a> J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+(EndMT)+during+vein+graft+remodeling.">TGF-&#946; signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition.">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF&#946;-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGF&#946;-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow.">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li><li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis.">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li><li>Chi, J. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling.">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells.">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بسبب الصعوبات في الحصول على نقية الثقافات TEC الابتدائي، العديد من الدراسات في المختبر TEC البديل مع خطوط EC المتاحة تجاريا أو EC الأولية مثل الوريد السري البشري EC (HUVEC) 13. ومع ذلك، هؤلاء السكان EC من الأنسجة الطبيعية قد إلا أن تكون بمثابة وكيل لTEC والتي تختلف بشكل...

الخلايا البطانية (EC) ضرورية خلال تطوير الأورام الصلبة. من الشروع في التحول عائية في الأورام النائمة لنشر وزرع البذور من الانبثاث في مواقع بعيدة، EC تشكيل القنوات التي توفر الدم والأكسجين والمواد المغذية للحفاظ على 1 نمو الورم. كما اقترح مؤخرا، لديها EC أيضا ظائف نضح مستقلة وتشكيل المتخصصة التي تدعم نمو الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا السرطانية اللحمية أخرى 2-5. وهكذا، منقى للغاية ويسمح ورم محددة EC (TEC) للثقافة في المختبر للدراسات وظيفية روتينية من شأنها أن تسلط الضوء على الآليات الجزيئية الجديدة التوسط الأوعية الدموية السرطانية وعبر الحديث مع الخلايا السرطانية. EC هي درجة عالية من التخصص اعتمادا على الأنسجة من أصل 6. ونظرا لطبيعة غير متجانسة من أنواع الأورام المختلفة والمكروية ورم، قد TEC أيضا عرض المزايا الفريدة التي تعكس ورم محددة التخصص سو الأوعية الدموية. على سبيل المثال، هناك تقلب اللافت للنظر في توقيع التعبير الجيني في TEC معزولة عن أنواع أو درجات من الأورام 7،8 مختلفة. ومع ذلك، وكثرة شارك في تنقية عدم EC، وخاصة الخلايا الليفية المرتبطة الورم والخلايا السرطانية، مع TEC يمكن أن تربك يحلل التعبير على نطاق الجينوم. هذه أنواع الخلايا غير المرغوب فيها هي إشكالية خاصة في الدراسات التي تعتمد على المدى الطويل في توسيع المختبر من الثقافات TEC. وصف هنا هو طريقة عالية الدقة التي تنتج باستمرار الثقافات EC نقية من الأورام والأنسجة الأخرى. بعد تخصيب العمود immunomagnetic الكسور EC وإزالة منقى المشترك غير EC، خطوة إضافية الاستنساخ الدائري للقبض على مستعمرات نقية EC يستخدم 9. كل مستعمرة يمكن توسيعها في الثقافة لمقاطع متعددة دون ظهور تلوث غير EC. هذا الأسلوب ينتج أيضا متعددة استنساخ EC من إجراء العزلة واحد، والذي يعتبر مثاليا لدراسة إندوعدم التجانس thelial. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يظهر أن Cdh5 لجنة المساواة العرقية: / لتر الفئران ZsGreen لتر / ثانية مراسل هي أداة قيمة لتوليد &quot;المعنونة مصير&quot; وتميز لا يمحى-EC التي تحافظ على ZsGreen مضان في الثقافة 10. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول، وينبغي أن تكون هذه الطريقة قابلة للتكيف مع أنواع الأورام المختلفة أو الأنسجة الطبيعية.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Bullet Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td>Not all components used</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (Hyclone)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Heat inactivated at 56 &amp;deg;C for 30 min</td></tr><tr><td>Nu-Serum IV</td><td>Corning</td><td>CB-51004</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBBS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 &amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>75% v/v ethanol for disinfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE microbeads&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260-37</td><td></td></tr><tr><td>Cell freezing media (Bambanker)</td><td>Wako Chemicals</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td>Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002004</td><td>Make stock concentration 1 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Dil-Ac-LDL</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td></td></tr><tr><td>Enzymatic cell detachment solution (Accutase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, 2% in water, tissue culture grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ML</td><td>Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution</td></tr><tr><td>Mouse FcR Blocking Reagent&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Neutral protease (Dispase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02104</td><td>Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS</td></tr><tr><td>PE-rat anti-mouse CD31 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4 %&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10 mm tissue culture dishes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes (sterile)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes (sterile)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator&amp;nbsp; (MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cloning rings (assorted sizes)</td><td>Bel-Art Products</td><td>378470000</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting board</td><td></td><td></td><td>Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting forceps and scissors</td><td></td><td></td><td>Sterilize before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting pins 2&quot;</td><td></td><td></td><td>Sterilize before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FACS tubes with 35 &amp;mu;m filter cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Filter cup (Stericup, 0.22 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tip marker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tissue adhesive (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation</td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue dissociator (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Preset program &quot;m_impTumor_01&quot; used for tissue dissociation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate or rotary shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells

المعزولة حديثا ورم محددة الخلايا البطانية (TEC) يمكن استخدامها لاستكشاف الآليات الجزيئية للورم الأوعية الدموية وتكون بمثابة نموذج في المختبر لتطوير مثبطات تكوين الأوعية الدموية الجديدة للسرطان. ومع ذلك، على المدى الطويل في توسيع المختبر من خلايا بطانة الأوعية الدموية الفئران (EC) يمثل تحديا بسبب الانجراف المظهري في الثقافة (البطانية-إلى-الوسيطة الانتقالية) والتلوث غير EC. هذا صحيح خصوصا بالنسبة TEC التي outcompeted بسهولة عن طريق الخلايا الليفية-تنقيته المشترك أو الخلايا السرطانية في ثقافة هذا. هنا، يتم وصف أسلوب العزل عالية الدقة التي تستفيد من تخصيب immunomagnetic إلى جانب اختيار مستعمرة والتوسع في المختبر. هذا النهج يولد الكسور EC نقية بحيث تكون خالية تماما من تلويث الخلايا اللحمية أو الورم. ويظهر أيضا أن-تتبع النسب Cdh5 لجنة المساواة العرقية: / لتر الفئران مراسل ZsGreen لتر / ثانية، وتستخدم مع بروتوكول صفت هنا، هي أداة قيمة للتحقق من خليةالنقاء كما المستعمرات EC معزولة من هذه الفئران تظهر دائم ورائعة مضان ZsGreen في الثقافة.

EC تمثل سوى جزء بسيط من مجموع السكان الخلية في معظم أنسجة البالغين 11. ولذلك فمن المهم لهضم تماما الأنسجة التي تحصد في تعليق وحيد الخلية يضمن الافراج القصوى من EC من المصفوفة خارج الخلية (ECM) والأنسجة الضامة. في تجربتنا، بوساطة CD31 اختيار immunomagnetic يوفر فقط المخصب ولكن...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

isolation-and-culture-expansion-of-tumor-specific-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models. 

Video: Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

توسيع فيفو السابقين الخلايا T ورم التفاعل من قبل وسائل 1/Ionomycin Bryostatin وصياغة سلسلة غاما المشتركة السيتوكينات

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Immunology and Infection

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Cancer Research

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Developmental Biology

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

عزل خلايا ورم القولون الإنسان الأساسية من الأنسجة الجراحية وزراعة بشكل مباشر على لينة مرنة ركائز للالجر الخلوي

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Bioengineering

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Biology

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Neuroscience

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional veins. The purpose of this article is to carefully describe the establishment of a murine xenograft model that mimics human VM and is able to reflect patient heterogeneity. Hyper-activating non-inherited (somatic) TEK (TIE2) and PIK3CA mutations in endothelial cells (EC) have been identified as the main drivers of pathological vessel enlargement in VM. The following protocol describes the isolation, purification and expansion of patient-derived EC expressing mutant TIE2 and/or PIK3CA. These EC are injected subcutaneously into the back of immunodeficient athymic mice to generate ectatic vascular channels. Lesions generated with TIE2 or PIK3CA-mutant EC are visibly vascularized within 7&#8210;9 days of injection and recapitulate histopathological features of VM patient tissue. This VM xenograft model provides a reliable platform to investigate the cellular and molecular mechanisms driving VM formation and expansion. In addition, this model will be instrumental for translational studies testing the efficacy of novel drug candidates in preventing the abnormal vessel enlargement seen in human VM.

We present a detailed protocol to generate a murine xenograft model of venous malformation. This model is based on the subcutaneous injection of patient-derived endothelial cells containing hyper-activating TIE2 and/or PIK3CA gene mutations. Xenograft lesions closely recapitulate the histopathological features of VM patient tissue.

نموذج Xenograft المستمدة من المريض للتشوه الوريدي

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

عزل CD133 خلايا + الجذعية الكبد للتوسع نسيلي

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.