الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة إنتاج معظم الجوانب الأساسية لمرض باركنسون في نموذج حيواني. التوصيل المجسمة للناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدية ، وترميز السيوكلين البشري في المادة السوداء. مرض باركنسون هو اضطراب تنكسي عصبي ينطوي على موت الخلايا العصبية الدوبامينية ، في المسار nigrostriatal ، وبالتالي ، تطور فقدان السيطرة على الحركة الطوعية.
ويرافق هذه العملية العصبية التنكسية ، عن طريق ترسب مجموع البروتين في الدماغ ، والتي تتكون أساسا من سينوكلين. وقد أشارت الأدلة الناشئة إلى أن مجاميع السيونوكلين يمكن أن تحفز المستقبلات الشبيهة بالرسوم على الخلايا الدبقية الصغيرة، وبالتالي تؤدي إلى التهاب عصبي في المادة السوداء. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة إلى أنه يمكن التقاط مجاميع سينوكلين وتقديمها ، عن طريق الخلايا التي تقدم المستضدات إلى الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية تكيفية خاصة ب synuclein.
وقد أظهر التسليم المجسمة للناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدية التي تشفر السيوكلين البشري في المادة السوداء ، أنه يعيد إنتاج العديد من الجوانب الأساسية للمرض ، بما في ذلك أمراض السينوكلين ، وتنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة ، وتنشيط الخلايا التائية ، والتنكس العصبي ، والإعاقة الحركية. تقدم هذه الدراسة تحليلا لكيفية تأثير الناقل الفيروسي والوقت الذي يلي توصيل الناقل الفيروسي ، على المدى على تعبير سينوكلين البشري ، والتنكس العصبي ، والالتهاب العصبي في المسار nigrostriatal ، وكذلك درجة الضعف الحركي في نموذج الفأر للتوصيل المجسمة أحادية الجانب للسينوكلين البشري في المادة السوداء. للحفاظ على بيئة معقمة ، ارتد ملابس جراحية مناسبة أثناء الجراحة بأكملها ، بما في ذلك أغطية الأحذية وقناع الجراحة والحاجز الصحي والقفازات وقبعة الجراحة.
رش الإيثانول على الفأر وجميع المواد الجراحية ، للحفاظ على البيئة المعقمة. للحث على التسكين ، حقن كاربروفين تحت الجلد كل 12 ساعة ، بدءا من ساعة واحدة قبل الجراحة ، ويستمر حتى ثلاثة أيام بعد الجراحة. لتخدير الماوس ، ضع الحيوان في غرفة حثية.
افتح تدفق الايزوفلوران بمعدل 0.5٪ ثم قم بزيادته ببطء حتى يصل إلى 5٪ على مدى خمس دقائق تقريبا حتى يفقد الماوس رد فعل التصحيح. إزالة الحيوان من غرفة الحث. انقل الحيوان على الفور إلى دائرة غير قابلة لإعادة التنفس باستخدام مخروط أنف بحجم مناسب.
الحفاظ على تخدير الفأر ، مع isoflurane 1 ٪ طوال فترة الجراحة. تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرص ذيوله ومخالبه. عندما لا يتفاعل الماوس عند قرص الذيل والكفوف ، فهذا يعني أن الماوس مخدر تماما.
حلق رأس الماوس باستخدام المقص. نظف جلد الفأر باستخدام قطعة قطن مع الكلورهيكسيدين 2٪ وإزالة كل الشعر. إصلاح رأس الماوس في الإطار المجسم.
ضع واقيا للقرنية في كلتا عيني الفأر ، باستخدام قطعة قطن. لمنع تحريض الإجهاد في القوارض الأخرى ، تجنب وجود أي فأر آخر في غرفة الجراحة. تنظيف رأس الفأر بثلاث جولات من الكلورهيكسيدين 2٪ متبوعا بالإيثانول 70٪ كشف الجمجمة باستخدام المواد الجراحية ، وعمل ثقب رفيع مع حفر عند إحداثيات أمامية خلفية 2.8 مم ، و 1.4 مم متوسطة الجانب ، فيما يتعلق بالخط الإنسي.
ضع إبرة حقنة 10 ميكرولتر في الحفرة ، وحرك الإبرة داخل الدماغ ببطء ، حتى تصل إلى 7.2 مم ظهرية بطنية ، احتراما للجافية. اترك الإبرة في الموضع النهائي لمدة دقيقتين ، للسماح للأنسجة بالاستقرار قليلا ، ثم حقن ميكرولتر واحد من النواقل الفيروسية في المادة الصحيحة nigra ، بمعدل 0.2 ميكرولتر كل 30 ثانية. اترك الإبرة في نفس الموضع لمدة خمس دقائق بعد تسليم النواقل الفيروسية ، ثم اسحبها ببطء.
أغلق الجرح باستخدام خياطة حريرية معقمة. ضع الماوس في قفص المنزل ، وتم تسخينه مسبقا عن طريق وضعه فوق مرتبة كهربائية دافئة. بعد 12 أسبوعا من الجراحة المجسمة ، قم بتقييم الأداء الحركي ، باستخدام نسخة مبسطة من اختبار الشعاع ، الموصوف من قبل.
لهذا الغرض ، استخدم شعاعا أفقيا بطول 25 سم وعرض 3 سم. يجب تغطية سطح الشعاع بشبكة معدنية بمربعات سنتيمتر واحد ، ورفع سنتيمتر واحد فوق الشعاع. قم بعمل فيديو للماوس ، أثناء اجتياز شعاع سطح الشبكة ، من طرف إلى الطرف الآخر من الشعاع ، حيث يقع القفص المنزلي.
تدريب الماوس لمدة يومين ، قبل تحديد أداء المحرك. في اليوم الأول ، قم بتدريب الماوس على المشي عبر الشعاع خمس مرات ، بدون الشبكة. في اليوم الثاني ، قم بتدريب الماوس على المشي عبر الشعاع ، في وجود الشبكة خمس مرات.
في اليوم الثالث ، قم بتقييم الأداء الحركي. للقيام بذلك ، قم بتحديد عدد الأخطاء التي تم تنفيذها ، بواسطة الكفوف اليسرى أو الكفوف اليمنى بشكل منفصل ، من خلال مشاهدة مقاطع الفيديو في وضع الحركة البطيئة. لتخدير الماوس ، حقن خليط من الكيتامين والزيلازين داخل الصفاق.
بمجرد تخدير الفأر بالكامل ، افتح الصدر بمواد جراحية ، وكشف القلب. ثم أدخل إبرة ذات طرف مسطح، في البطين الأيسر للقلب. عن طريق اقتران الإبرة بأنبوب ، قم بدمج 50 ملليلتر من محلول ملحي عازل للفوسفات ، بمعدل 9.5 ملليلتر في الدقيقة ، باستخدام مضخة تمعجية.
قم بإزالة الدماغ باستخدام المقص والملقط ، ثم قم بإصلاحه عن طريق الغمر ، في خمسة ملليلتر من 4٪ paraformaldehyde ، في محلول ملحي عازل للفوسفات. بعد ذلك ، ضع الدماغ الثابت ، في 15 ملليلتر من 30 ٪ من السكروز لمدة 48 ساعة. ثم ضع الدماغ في أربعة ملليلترات من محلول الحماية من التبريد ، واحفظ الدماغ عند 80 درجة ، أو استخدمه على الفور في الخطوة التالية.
للحصول على شرائح مخططة ، قم بقطع الدماغ إلى أقسام بسماكة 40 ميكرومتر ، تبدأ من 1.34 مم ، وتنتهي عند 0.26 مم. حصاد كل شريحة في أنبوب تبريد ملليلتر ، باتباع الترتيب الأمامي الخلفي. لإجراء التحليل الكيميائي المناعي والكيميائي المناعي والفلورسنت المناعي في المخطط ، اختر خمسة أقسام خطية إكليلية مأخوذة على فترات منتظمة ، والتي تغطي كامل المدى الوردي الذيلي للنواة.
للتحقق من صحة التسليم الصحيح للناقلات الفيروسية في الخلايا العصبية الدوبامينية في مسار nigrostriatal ، تم حقن النواقل التي تشفر GFP ، في المادة السوداء ، وبعد 12 أسبوعا ، تم تحليل التألق GFP والتفاعل المناعي لهيدروكسيلاز التيروزين في المادة السوداء والمخطط بواسطة التألق المناعي. كان التألق المرتبط ب GFP ، موجودا حصريا في الموقع الجانبي ، ولوحظ توطين مشترك كبير مع التفاعل المناعي لهيدروكسيلاز التيروزين في كل من المادة السوداء والمخطط ، مما يشير إلى التسليم الصحيح للناقلات الفيروسية في الخلايا العصبية الدوبامينية للمسار nigrostriatal. لاختبار جرعة النواقل ، يتطلب ترميز synuclein ، للحث على الإفراط الكبير في التعبير عن synuclein البشري الذي يعزز التنكس العصبي للخلايا العصبية الدوبامينية النيجيرية ، تم حقن جرعات مختلفة من النواقل.
وبعد 12 أسبوعا ، تم اختبار التفاعل المناعي للسينوكلين البشري ، ومدى التفاعل المناعي لهيدروكسيلاز التيروزين في المسار الزنجي الأذيني. كان التفاعل المناعي للسينوكلين البشري واضحا ، حيث تم اختبار جميع الجرعات في المادة السوداء. ومع ذلك ، فإن الفئران فقط التي تتلقى 10 إلى 10 جينومات فيروسية لكل فأر ، قدمت تفاعلا مناعيا واضحا للسينوكلين البشري ، في المخطط.
أظهرت الفئران التي تتلقى 10 إلى 10 جينومات فيروسية لكل فأر من النواقل التي تشفر السينيوكلين البشري ، فقدانا كبيرا للخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء. على الرغم من أن الفئران التي تتلقى نفس الجرعة من النواقل التي تشفر GFP ، أظهرت درجة منخفضة من فقدان الخلايا العصبية ، إلا أن هذه الفئران قدمت درجة أقل بكثير من التنكس العصبي ، مقارنة بتلك الفئران التي تتلقى ناقلات ، وترميز السينوكلين البشري. باستخدام اختبار الشعاع ، تم الكشف عن انخفاض كبير في الأداء الحركي حصريا في تلك الفئران ، حيث تلقت 10 إلى 10 جينومات فيروسية لكل فأر من النواقل التي تشفر السيوكلين البشري ، عند مقارنة عدد الأخطاء التي ارتكبتها الكفوف اليمنى واليسرى ، أو عند مقارنة العدد الإجمالي للأخطاء ، من الفئران التي تتلقى ناقلات ترميز السيونوكلين البشري ، مع تلك الفئران التي تتلقى ناقلات المكافحة.
لتحديد بداية التعبير عن السينوكلين البشري ، عولجت الفئران ب 10 إلى 10 جينومات فيروسية لكل فأر ، من ناقلات تشفر سينوكلين البشري ، أو جراحة صورية ، وتم تحليل مدى تعبير سينوكلين البشري في المادة السوداء ، مرة واحدة في الأسبوع ، خلال الأسابيع من أسبوعين إلى خمسة بعد الجراحة المجسمة. تظهر النتائج أن تعبير سينوكلين البشري بدأ واضحا في الأسبوع الخامس بعد الجراحة المجسمة. لتحديد ذروة التنشيط الدبقي الصغير ، تم تحديد مدى الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من Iba1 ، كميا في مخطط الفئران ، خلال الأسابيع 2-15 بعد الجراحة.
تظهر النتائج زيادة كبيرة في التنشيط الدبقي الصغير للجانب الجانبي ، مقارنة بالجانب المقابل للفئران ، بعد 15 أسبوعا من التلقيح الفيروسي. تم تحليل عدد الخلايا التائية التنظيمية التي تسللت إلى الزنبق الكبير في نقاط زمنية مختلفة ، بعد الجراحة المجسمة بواسطة التألق المناعي ، تليها المراقبة المجهرية البؤرية. لوحظت ذروة تسلل الخلايا التائية التنظيمية إلى المادة السوداء في الأسبوع 11 بعد الجراحة.
يمثل نموذج الفأر للتنكس العصبي الذي تم تحليله هنا نموذجا مفيدا لدراسة أرقام مشاركة الجانب الرئيسي في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون. آليات المشاركة المشاركة في علم أمراض سينوكلين ، وتنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة ، وإشراك الجهاز المناعي المحيطي ، في التهاب الأعصاب ، وآليات التنكس العصبي جرعة مناسبة من ناقل فيروسي مرتبط بالغدي ، النوع الفرعي الخامس ترميز سينوكلين البشري للحث على التنكس العصبي ، التهاب الأعصاب ، تسلل الخلايا التائية ، والإعاقة الحركية ، هو 10 إلى 10 جينومات فيروسية لكل فأر. تظهر هذه الدراسة ، أنه بعد خمسة أسابيع من الجراحة المجسمة ، تشكل نقطة زمنية رئيسية ، حيث كان تعبير السيوكلين البشري واضحا بالفعل ، ولكن في غياب ضعف حركي في هذا النموذج الحيواني.
وبالتالي ، تمثل هذه النقطة الزمنية نقطة زمنية مثيرة للاهتمام ، لبدء إدارة العلاجات التجريبية المصممة خصيصا لوقف تقدم الالتهاب العصبي والتنكس العصبي. النقطة الزمنية الأنسب لتحليل التهاب الأعصاب في هذا النموذج الحيواني ، هي في الأسبوع 15 بعد الجراحة المجسمة. في حين أن نقطة زمنية مناسبة لتحليل تسلل الخلايا التائية إلى الجهاز العصبي المركزي.
يبدو أنه في الأسبوع 11 بعد التطعيم بالنواقل الفيروسية.
