القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو الفلوريسين ثنائي كلورو فلوريسين 2′,7′ وقياس التدفق الخلوي في خلايا مولر الدبقية

هناك عدة طرق لقياس إنتاج ROS ، أو الإجهاد التأكسدي في الخلايا. من بين هذه ، 2'7'dichlorofluorescein ثنائي أسيتات التحقيق هي واحدة من أكثر التقنيات استخداما على نطاق واسع لقياس حالة الأكسدة والاختزال مباشرة. هذا المسبار محب للدهون وغير فلورسنت. يسمح انتشار هذا المسبار عبر غشاء الخلية بانقسام الإستراز داخل الخلايا في رابطتي الإستر ، مما ينتج منتجا قطبيا نسبيا وغير منفذ بغشاء الخلية. تتراكم هذه الجزيئات غير الفلورية داخل الخلايا ، وتنتج الأكسدة اللاحقة بواسطة ROS المنتج عالي الفلورسنت ثنائي كلورو فلوريسين. أكسدة المسبار هي نتاج عمل أنواع متعددة من ROS. والتي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري. في هذه المقالة ، استخدمنا مسبارا ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسين لقياس وقياس ROS عن طريق قياس التدفق الخلوي. انقل لوحات 6 آبار إلى غطاء تدفق صفائحي من الحاضنة. شفط السوبرناتانت. واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. أضف 2 مل من مصل DMEM منخفض لكل بئر. واحتضن لوحة 6 بئر لمدة ساعتين في الحاضنة. علاج الخلايا مع مضادات الأكسدة لمدة ست ساعات. عالج الخلايا باستخدام محفز ROS ، A أو B ، لمدة 30 دقيقة. شفط السوبرناتانت. واغسل الخلية ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة جميع المحفزات. أطفئ ضوء غطاء التدفق الرقائقي واعمل في الظلام. أضف 1 مل من مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسين في DMEM بدون الفينول الأحمر. أضف 1 مل من DMEM بدون الفينول الأحمر إلى خلايا التحكم في التألق الذاتي. احتضن لوحة 6 بئر لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. انقل الألواح على الجليد إلى المختبر. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من PBS البارد لكل بئر. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المنفصل البارد إلى كل بئر. حصاد الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000. اجمعها في أنبوب 1.5 مل. وقم بطردها مركزيا عند 600 × g لمدة خمس دقائق عند 4 C.تخلص من supernatant بعناية ، وافصل الحبيبات بلطف مع التنصت. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا إلى كل أنبوب ملصق. إذا لزم الأمر ، استخدم الدوامة بأقل كثافة للانفصال الكامل للبيليه. قم بطردها مركزيا عند 600 × g لمدة خمس دقائق عند 4 C.كرر هذه الخطوة مرتين أكثر. ثلاث غسلات في المجموع. أعد تعليق كريات الخلايا في 200 لتر من المخزن المؤقت FACS. افصل بلطف الكريات تماما في كل أنبوب باستخدام الدوامة. ونقل إلى 5 مل المسمى لأنابيب التدفق الخلوي. احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى يتم تحليلها على مقياس التدفق الخلوي. باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي ، قم بإنشاء تجربة جديدة. انقر فوق العينة وسيقوم بفتح قائمة بالأنابيب. انقر نقرا مزدوجا فوقها وأعد تسميتها. ضع أنبوب التحكم في التألق الذاتي على ذراع الشافط، مع تحريك القاعدة بعناية إلى اليسار فقط. انقر فوق الحصول على البيانات ثم فوق تسجيل البيانات، وحدد شرط الإيقاف المطلوب. ارسم بوابة حول الخلايا المثيرة للاهتمام ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام. قم بإزالة الأنبوب. انقر فوق الأنبوب التالي وقم بتشغيل نموذج التحكم الأساسي. انقر فوق الحصول على البيانات ثم في سجل البيانات.افتح البرنامج. أضف العينات باستخدام زر الإجراء إضافة عينات. انقر فوق إضافة عينة.حدد مجلد التاريخ التجريبي وانقر فوق اختيار.انقر نقرا مزدوجا فوق العينة الأولى في مساحة العمل، عنصر تحكم التألق التلقائي في هذه الحالة. ارسم بوابة مضلع لعزل الخلية ذات الأهمية ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام. تغيير المؤامرة إلى رسم بياني. انقر نقرا مزدوجا داخل M