يقارن هذا البروتوكول بين تقنيتي تشتت رامان المتماسكة فائقة الطيف الأكثر استخداما على نطاق واسع بما في ذلك تشتت رامان المضاد لستوكس وعمليات تشتت رامان المحفزة وهذا يسمح لعلماء الأحياء باختيار أفضل طريقة تصوير لتطبيقاتهم البيولوجية. باستخدام التوقيعات الاهتزازية الجوهرية ، فإن التحليل الطيفي رامان المتماسك قادر على رسم خريطة للمعلومات الكيميائية والعينات البيولوجية دون الحاجة إلى وضع علامات خارجية. وقد وسع مجهر رامان المتماسك فهمنا لعملية التمثيل الغذائي الخلوي، ورسم الخرائط، وتوزيع الأدوية، وتشخيص الأمراض، وتحديد التغيرات الكيميائية.
هذه تقنية تتطلب تدريبا كافيا في كل من البصريات والتحليل الطيفي. أوصي بقراءة بعض مقالات المراجعة والتدريب من قبل خبير قبل استخدام هذه التقنية. للبدء ، قم بإعداد شرائح التصوير عن طريق وضع قطعة من الشريط على الوجهين على زلة غطاء وقطع شكل مستطيل صغير من الشريط من منتصف الشريط لإنشاء منطقة مفتوحة لوضع العينة.
ماصة 1-2 ميكرولتر من DMSO النقي وتوزيع القطيرة في وسط الوظيفة الشاغرة. ضع زلة الغطاء العلوي بعناية وضع حواف زلات الغطاء برفق لإغلاق الغرفة مع التأكد من أن عينة DMSO لا تلامس حواف الشريط. بالنسبة لتجارب الحساسية ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية ل DMSO في أكسيد الديوتيريوم لإعطاء نطاق تركيز من 50 إلى 0٪ خذ 1 إلى 2 ميكرولتر من كل محلول وقم بإعداد عينات مضغوطة كما هو موضح سابقا.
ضع العينة على مرحلة المجهر وأضف الماء أو زيت الغمر إذا لزم الأمر للعدسة الموضوعية أو المكثف. حرك حافة قطرة DMSO بشكل صحيح في مجال الرؤية واضبط العدسة الموضوعية للحصول على أفضل تركيز بؤري ، ثم قم بتوسيط المكثف باستخدام طريقة إضاءة Kohler وافتح الحجاب الحاجز بالكامل على المكثف. بعد ذلك ، اضبط الطول الموجي لشعاع المضخة إلى 800 نانومتر لاستهداف ذروة الرقم الموجي 2913 CH3 وضبط قوة كل من المضخة وشعاع ستوكس على حوالي 30 مللي واط قبل المجهر عن طريق ضبط نصف الصفيحة الموجة.
بالنسبة إلى SRS، اضبط كسب مضخم القفل على 10 تقريبا مع ثابت زمني يبلغ 7 ميكروثانية، مما يضمن أن يكون ثابت الوقت أصغر من وقت سكن البكسل. اضبط معلمات الحصول على الصورة وبرنامج الاقتناء باستخدام رقم بكسل 200 × 200 بحجم مسح يبلغ حوالي 100 × 100 ميكرومتر مربع ، مما يضمن احتواء الصورة على كل من قطرة DMSO ومنطقة فارغة ، ثم مسح العينة ضوئيا والتحقق من الصورة على شاشة الكمبيوتر. بعد ذلك ، قم بمسح صورة التأخير الآلية في شعاع مضخة Stokes أثناء مراقبة الصور في الوقت الفعلي والمسح الضوئي فوق التأخير حتى يتم تعظيم الإشارة.
حرك قطرة DMSO لتغطية مجال الرؤية بالكامل وتحقق مما إذا كان الحد الأقصى لإشارة التيار المستمر متمركزا في الصورة لأن الإشارة تعتمد على شعاع المضخة. اضبط إما موضع شعاع المضخة عبر مرآة أو إزاحة الجهد في برنامج التصوير. بعد تحسين التيار المستمر، اضبط مرايا شعاع ستوكس حتى يتم تكبير إشارة التيار المتردد عن طريق ضبط قيمة العتبة لعرض تشبع 50٪ تقريبا مع التحقق من تمركز التشبع في الصورة.
إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بضبط المرايا فقط في شعاع Stokes وراقب الإشارة أثناء المحاذاة كملاحظات في الوقت الفعلي على جودة المحاذاة. لتحليل SNR ، افتح برنامج ImageJ واستورد نموذج الملف النصي DMSO المحفوظ بالنقر فوق ملف ، ثم استيراد ، متبوعا بخيارات صورة النص وفتح من القائمة المنسدلة. بمجرد استيراد الصورة، اضغط على Control Shift C لإظهار وظيفة السطوع والتباين، ثم اضغط على الزر تلقائي في وظيفة السطوع والتباين حتى تظهر منطقة عينة DMSO مشبعة للعثور على أقصى إشارة عينة.
بعد ذلك ، انقر فوق أداة التحديد البيضاوي على واجهة ImageJ وقم بتمييز مساحة صغيرة من منطقة DMSO المشبعة. بعد التمييز، اضغط على M لقياس المتوسط والانحراف المعياري للمنطقة المحددة. لقياس الخلفية، اضبط الأشرطة في وظيفة السطوع والتباين حتى يمكن ملاحظة إشارة المنطقة الفارغة، ثم انقر فوق التحديد البيضاوي وقم بتمييز منطقة من الخلفية، مما يضمن أن المنطقة المحددة لا تحتوي على DMSO.
بعد ذلك، اضغط على M لقياس إحصائيات المنطقة المحددة. بعد ذلك ، احسب SNR كما هو موضح سابقا عن طريق قياس قيمة متوسط الضوضاء وقيمة متوسط الإشارة إلى جانب الانحراف المعياري. لمعالجة صور CRS فائقة الطيف ، قم باستيراد الملف النصي بالنقر فوق ملف ، ثم استيراد ، صورة نصية ، وفتح الخيارات من القائمة المنسدلة.
بمجرد استيراده ، انقر فوق صورة ، ثم مكدسات ، متبوعة بأدوات ومونتاج إلى خيارات تكديس لتحويل الملف إلى مكدس صورة ، ثم قم بالتمرير عبر المونتاج حتى تصبح ذروة DMSO الأولى مرئية. حدد منطقة على DMSO وانقر على صورة، متبوعة بخيارات ملف تعريف المحور Z للمكدس والرسم لرسم طيف الكثافة مقابل رقم الإطار. بعد ذلك ، انقر فوق قائمة وانسخ بيانات ملف التعريف لاستخراج البيانات الطيفية الخام.
لتحويل الطيف المسترد إلى وحدات تردد، قم بإجراء انحدار خطي باستخدام CH المتماثل وغير المتماثل الممتد من DMSO وأرقام الإطارات المقابلة لها. تم قياس الاستبانة الطيفية ل DMSO باستخدام مجهر SRS و CARS فائق الطيف ، والذي يظهر دقة 14.6 و 17.1 على التوالي ، مما يشير إلى أن SRS لديه دقة طيفية أفضل. تم الحصول على أطياف DMSO SRS بتركيزات 0.1 و 0.01٪ حيث يمكن حل الذروة عند الرقم الموجي 2913 في الأول ، ولكن ليس في الأخير ، مما يشير إلى أن حد الكشف يتراوح بين 0.1 و 0.01٪ DMSO.
تظهر أطياف CARS المستردة مرحليا أن ذروة الرقم الموجي DMSO 2913 يمكن حلها بوضوح ل 0.1٪ DMSO ، ولكن ليس 0.01٪ مما يشير إلى حد الكشف بين هذين التركيزين. أظهرت ملفات تعريف كثافة SRS و CARS لخلية MIA PaCA-2 أن إشارة SRS أعطت دقة 398.6 نانومتر ، في حين أعطت إشارة CARS دقة أفضل 1.2 مرة من 330.3 نانومتر. تظهر صور SRS و CARS من خلايا MIA PaCa-2 في مواضع تأخير بصرية مختلفة أقوى الإشارات مع قطرات الدهون كنقاط ساطعة ل SRS ، في حين أن CARS لديها تباينات أقل بكثير.
ومع ذلك ، فإن التحول الأحمر في الرقم الموجي 37 في التركيز الطيفي أدى إلى تحسين تباينات الدهون لكل من SRS و CARS. تظهر أطياف SRS إشارة أقوى بكثير عند 2850 رقما موجيا لقطرات الدهون من العضيات الأخرى ، في حين تظهر أطياف CARS انزياحا أحمر صغيرا. لتحسين إشارة تشتت رامان المتماسكة، ابحث أولا عن تركيز العينة، ثم اضبط التأخير البصري، وأخيرا قم بضبط المرايا بدقة حتى يتم تحقيق الحد الأقصى.
يتم دمج تقنيات مسبار المضخة الأخرى ، مثل الامتصاص العابر بطبيعتها في منصة CRS. هذه التقنية قوية جدا لقياس حركية امتصاص الجزيئات القوية غير الفلورية التي تمتص الضوء. تسمح هذه التقنية للباحثين بعرض الجزيئات الصغيرة بطريقة خالية من الملصقات مع نشاط خلوي كيميائي مرتفع.
كما يسمح للباحثين بعرض التغيرات في استقلاب الدهون ، والديناميكيات داخل الخلايا ، وتوزيع الأدوية.
