نود أن نشكر إيوان Schie وسيباستيان Wachsmann - Hogiu لما قدموه من مساهمات في تطوير تقنية DR - السيارات. تايلر أسبوعين يقر الدعم المقدم من برنامج الباحث لورنس من مختبر لورانس ليفرمور. توماس Huser تشعر بالامتنان للدعم من رابطة القلب الأميركية من خلال برنامج المنح في والمعونة. كما أيد هذا العمل في جزء من التمويل من مؤسسة العلوم الوطنية. ويدير مركز بيوفوتونيك ، وجبهة الخلاص الوطني ومركز علوم التكنولوجيا ، من جامعة كاليفورنيا في ديفيز ، في إطار الاتفاق التعاوني رقم 0120999 PHY. ومن المسلم به أيضا دعما من مركز العلوم السريرية UCD بالحركة تحت رقم UL1 RR024146 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (NCRR).

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

رامان التحليل الطيفي والتصوير رامان المستندة إلى أدوات قوية الناشئة في مجال العلوم البيولوجية. حاليا ، هذا صحيح لا سيما بالنسبة للفي الجسم الحي والدراسة في المختبر من الأيض الخلوي والاضطرابات الأيضية في معالجة وتخزين الدهون. معظم الجزيئات الحيوية تحتوي على عدد كبير من سندات مماثلة ، الجزيئية في معظمها تقوم على الكربون ، بحيث أطياف رامان تم الحصول عليها من خلايا الكائنات الحية وعادة ما تكون الإلتواء المساهمات من الدهون والبروتينات والأحماض النووية ، والسكريات ، والدهون غير ذلك من السهل نسبيا لعزل من هذه الأطياف المعقدة ، وذلك بسبب ميلها لتشكيل قطرات كثيفة وطبقات ثنائية أو لأنها تحتوي على سلاسل طويلة مع عدد كبير من السندات CH الأليفاتية. قدرتنا على عزل بروتينات معينة ، والأحماض الأمينية ، والجيش الملكي النيبالي ، أو الحمض النووي داخل الخلايا البيئة المعقدة ، مع ذلك ، محدودة جدا. هذا صحيح بصفة خاصة إذا كانت هذه الجزيئات من الفائدة موجودة فقط في تركيزات ميكرومتر وما دونها. هنا ، والقدرة على تحقيق الاستفادة من ضعف رامان الأصداء التي أدخلت حديثا لدينا فرق التصوير DR - السيارات تقنية يوفر نهجا قوية لتحليل مجهري الكيميائي والتصوير. باعتراف الجميع ، والجزء الأكثر تعقيدا من هذا البروتوكول هو التوافق والتزامن لنظام ليزر. عندما تبدأ من الصفر ، وتزامن البقول ، وضمان أن يتم أي تداخل النبضات في الوقت المناسب على الرغم من أنها تأخذ مسارات مختلفة يمكن أن تيسره استخدام autocorrelator النبض. ويتحقق التداخل المكاني والزماني مرة واحدة والسيارات وDR - السيارات إشارات ينبغي كشفها بسهولة. ومع ذلك ، فإن المحاذاة الأول هو الغالب الخام ، مما أدى إلى إشارات ضعيفة. أفضل الممارسات لمواءمة هذا النظام بشكل جيد يهدف الى توليد إشارات ضعيفة في البداية ومن ثم لتحسين قوة الإشارة التي اللف برفق المرايا على طول كل المسار وضبط التداخل الزمني باستخدام مراحل تأخير. على الرغم من تحول أعمال مطياف / مستوحد اللون كما يربك فعالة جدا للضوء الغرفة يمكن تحقيق نتائج أنظف من خلال تشغيل النظام مع أضواء الغرفة قبالة والستائر أو أنابيب للحد من عدسة خلفية عرضه مصادر الضوء المختلفة الأخرى (مثل شاشات الكمبيوتر ، أضواء المؤشر ، المصابيح ، إلخ). الإعداد لدينا خاصة ويستخدم الفوتون المفرد عد سيل الصور ديود (APD) للكشف عن وتستغرق وقتا ترتبط العد فوتون واحد (TCSPC) أجهزة للكشف عن 5. وهذا يمكننا من الكشف عن اشارات ضعيفة للغاية مع ضوضاء منخفضة نسبيا لكن جماعات كثيرة وجدت الصور المضاعف أنابيب (PMT) مع الحصول على فائدة متغير عند إجراء القياسات مماثلة. ميزة لPMT هو أنها توفر كسب متغير ويكون لها مجال الكشف عن أكبر بكثير مما يمكن تبسيط محاذاة كاشف. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم الإعداد لدينا مراحل بيزو لترجمة موضوعية من أجل تحقيق المسح شعاع. وميزة هذا هو أن لدينا القدرة على العودة الى أي بقعة داخل الصورة الممسوحة ضوئيا من قبل مع وجود درجة عالية من الدقة وأخذ قياسات إضافية بما في ذلك أطياف رامان عفوية. وكانت الجماعات الأخرى الناجحة باستخدام مرآة المجالس المسح الضوئي ، أو حتى كامل وحدات المسح مبائر مثل نظام FluoView أوليمبوس ، والذي يقدم التصوير أسرع بكثير ولكنها محدودة في قدرتها على العودة إلى مواقع على وجه التحديد التعسفي داخل صورة. توليف ليزر لمطابقة الرنين رامان هو أيضا خطوة الحرجة التي قد تتطلب بعض التحسين. رغم أنه قد يكون معروفا القمم رامان أقصى ذروة الكثافة الطيفية التي تم الحصول عليها من DR - السيارات والسيارات لا تتوافق بالضرورة إلى أقصى ذروة رامان عفوية. هذا ومن المقرر أن تدخل جوهري من الإشارات التي تولدها أربع موجة خلط يؤدي إلى إشارة الخلفية غير الرنانة والسيارات ، الأمر الذي يشوه السيارات أطياف أطياف رامان النسبي للعفوية. ويمكن حساب الموقع الطيفية للذروة إشارة السيارات ، ولكن اتباع نهج أكثر واقعية هو توليف OPOS في عدة خطوات صغيرة الطيفية عبر الموقع المتوقعة من الرنين رامان. هذه العملية يجب أن تسفر عن الحد الأقصى واضحة. في الواقع ، لا بد لأكبر من الحساسية DR - FWM يمكن ضبطها سواء الأصداء إلى هذا الحد الأقصى. مشكلة واحدة محتملة للنهج مشاركة DR - السيارات أيضا أن تتم مناقشة أي إشارة DR - السيارات سوف يعتمد على توزيع متجانس للجزيء رامان النشطة تضخيم. لكائنات معظم البيولوجية ، وهذا يمكن أن يكون جيدا OH صدى واسع من المياه ، وهي وفيرة ومنتشرة في كل مكان تقريبا. هو والمياه ومع ذلك ، يستبعد من المناطق مسعور مع خلية ، مثل قطرات الدهون ، مما يؤدي إلى تشويه الإشارات التي تم الحصول عليها باستخدام الرنين عندما المياه لتضخيم وسائط الدهون. في مثالنا ، وقد استخدمنا محلول الجلوكوز deuterated لتوليد إشارة يمكن كشفها بسهولة وفيرة لدينا عينة بيولوجية. وبالمثل ، deuterated الماء أو deuterated buffe البيولوجيةويمكن استخدام التمرير ، مثل د HEPES. في مثالنا ، والدهون داخل قطرات C. وايليجانس دودة صغيرة بما يكفي لاحتواء كل الأحوال ، فإن الحل deuterated الجلوكوز والدهون في بقعة الليزر المركزة لنظامنا. هذا ، ومع ذلك ، لا ينطبق عموما. ومن الأمثلة سيما أن الخلايا الشحمية ، التي تولد قطرات الدهون بدلا كبيرة داخل السيتوبلازم بهم. وهذا يعني ، أي التجربة التي أجريت مع تقنية DR - السيارات يتطلب إعدادا دقيقا ومراقبة التجارب للتحقق من النتائج.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

شهدت تماسكا تقنيات التصوير رامان زيادة كبيرة في النشاط على مدى العقد الماضي بسبب وعودهم لتمكين التسمية خالية التصوير الضوئي مع خصوصية عالية الجزيئية 1. حساسية هذه التقنيات ، ولكن ، العديد من الطلبات من حيث الحجم أضعف من مضان ، تتطلب ملي المولي 1،2 تركيزات الجزيئية. هنا ، نحن تصف تقنية يمكن المساعدة في الكشف عن تركيزات منخفضة من ضعف أو رامان الجزيئات النشطة عن طريق تضخيم الإشارة مع ذلك تم الحصول عليها من الذاريات رامان قوية أو وفيرة. تفاعل الليزر نابض قصيرة في عينة بيولوجية يولد مجموعة متنوعة من متماسكة اشارات تشتت رامان ، كل منها تحمل فريدة عن المعلومات الكيميائية العينة. عادة ، يتم استخدام واحد فقط من هذه الإشارات ، على سبيل المثال المتماسك رامان نثر المضادة للستوكس (السيارات) ، لتوليد صورة بينما يتم تجاهل الآخرين. ومع ذلك ، عندما يتم تجميع هذه الإشارات الأخرى ، بما في ذلك 3 ألوان السيارات وأربع موجة خلط (FWM) ، وبالمقارنة مع إشارة للسيارات ، يمكن استخراجها من الصعب على خلاف ذلك للكشف عن المعلومات 3. على سبيل المثال ، السيارات ، مضاعفة الرنانة (DR - CARS) هو نتيجة للتداخل البناء بين إشارتين الرنانة 4. نحن لشرح كيفية ضبط للأشعة الليزر الثلاثة المطلوبة لإنتاج السيارات DR - إشارات إلى 2845 سم -1 الاهتزاز تمتد CH في الدهون والاهتزاز 2120 سم -1 CD تمتد من جزيء deuterated (السكريات deuterated مثل الأحماض الدهنية ، الخ.) يمكن استخدامها لتحقيق كل من الأصداء رامان في وقت واحد. في ظل هذه الظروف ، بالإضافة إلى إشارات السيارات من كل الرنين ، مجتمعة DR - CARS إشارة التحقيق ولدت أيضا على حد سواء. نحن لشرح كيفية اكتشاف الفرق بين إشارة DR - السيارات وتضخيم إشارة من الاهتزاز وفيرة لجزيء يمكن استخدامه لتعزيز حساسية لضعف الإشارة. نظهر أيضا أن هذا النهج يمتد حتى إلى التطبيقات التي يتم إنشاؤها على حد سواء اشارات من جزيئات مختلفة ، مثل أن استخدام مثل إشارة قوية من رامان مذيب يمكن أن تعزز إشارة ضعيفة رامان لتمييع المذاب.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS at JoVE.com

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

يتم استخدام مزيج من ثلاثة واحد ليزر نابض قصيرة الطول الموجي لتوليد متماسكة لمكافحة ستوكس رامان نثر (السيارات) والسيارات ، مضاعفة الرنانة (DR - CARS). الفرق بين هذه الإشارات يوفر زيادة في الحساسية للخلاف من الصعب اكتشاف إشارات رامان متماسكة ، مما يتيح تصوير الذاريات رامان ضعيفة.

التصوير الفرق البنيات البيولوجية مع المضاعفة - الرنانة نثر المضادة للستوكس المتماسك رامان (سيارات)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K Views.  University of California, Davis. يتم استخدام مزيج من ثلاثة واحد ليزر نابض قصيرة الطول الموجي لتوليد متماسكة لمكافحة ستوكس رامان نثر (السيارات) والسيارات ، مضاعفة الرنانة (DR - CARS). الفرق بين هذه الإشارات يوفر زيادة في الحساسية للخلاف من الصعب اكتشاف إشارات رامان متماسكة ، مما يتيح تصوير الذاريات ?...

Video: Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

وعلى النقيض من مرحلة التدخل التفاضلية المجهري التباين (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

التوليف ومعايرة Nanoprobes الفسفورية للتصوير الأوكسجين في النظم البيولوجية

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

تحليل وبناء هياكل الحمض النووي مع 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

تنفيذ نظام متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS) على تي: الياقوت وOPO بالليزر القائم ستاندرد الليزر الضوئي مجهر

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

الأسفار الانتعاش بعد p62 "فوتوبليتشينج من الأصفر فلوري البروتين معلم" في "الهياكل التي يسببها" مثل أجريسومي

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

التصوير الشعاعي النيوتروني والتصوير المقطعي المحوسب للأنظمة البيولوجية في مفاعل النظائر عالي التدفق التابع لمختبر أوك ريدج الوطني

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...