يستخدم هذا البروتوكول مزيجا من التهجين في الموقع والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وهو بمثابة طريقة سهلة وفعالة لتحليل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. ينطبق هذا البروتوكول على الأجنة في مراحل مختلفة ، وأقسام الأنسجة ذات السماكة المختلفة ، والأعضاء المختلفة. للبدء ، قم بتثبيت ما يقرب من 10 أجنة تحتوي على 0.5 إلى 1 ملليلتر من بارافورمالدهايد الطازج 4٪ في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر عند أربع درجات مئوية طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة.
قم بتجفيف الأجنة تدريجيا عن طريق غسلها ب 25 و 50 و 75٪ ميثانول في PBST على التوالي لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأجنة في ميثانول 100٪ لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأجنة في ميثانول 100٪ عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل على الأقل ، لمدة 12 إلى 14 ساعة.
أعد ترطيب الأجنة تدريجيا عن طريق غسلها ب 75 و 50 و 25٪ ميثانول في PBST على التوالي لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الجنين ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة خمس دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. هضم الأجنة مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من البروتيناز K في PBST في درجة حرارة الغرفة ، وغسل الأجنة ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق.
ثم ، قم بإعادة إصلاح الأجنة المغسولة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الجنين ثلاث مرات باستخدام PBST أثناء الحضانة لمدة خمس دقائق أثناء كل غسلة. للتهجين المسبق للأجنة ، احتضانها في محلول ما قبل التهجين عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، استبدل محلول ما قبل التهجين بمحلول التهجين وقم بالتهجين المسبق لمدة أربع ساعات على الأقل. سخني المسبار في محلول التهجين لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية قبل إضافته إلى الأجنة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول ما قبل التهجين دون السماح للأجنة بالتلامس مع الهواء.
إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة ، أضف مسبارا مسخنا مسبقا في محلول التهجين واترك المسبار يهجن طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة عند 50 إلى 70 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بنضح محلول المسبار باستخدام ماصة وقم بتخزينه في أنبوب عند 20 درجة مئوية تحت الصفر بحيث يمكن إعادة استخدامه عدة مرات. اغسل الأجنة بمحلول تهجين 100٪ متبوعا بغسل متسلسل بمحلول تهجين 75 و 50 و 25٪ بتركيز ضعف SSCT لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
ثم اغسل الأجنة مرتين و 0.2 مرة من تركيز SSCT لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. اغسل الأجنة مرتين لمدة 10 دقائق في MABT في درجة حرارة الغرفة. سد الأجنة المهجنة والمغسولة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، مع 2٪ محلول مانع -1.
استبدل محلول الحجب -1 بمضاد الفوسفاتيز القلوي antidigoxigenin في محلول مانع جديد بنسبة 2٪ -1 ورجه طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الأجنة أربع مرات في MABT لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الأجنة مرتين في NTMT وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من NTMT من الأجنة باستخدام ماصة.
استبدل مع الركيزة الفوسفاتيز القلوية BM الأرجواني وصمة عار الأجنة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بمجرد تطور البقعة ، أوقف التفاعل عن طريق الشطف لفترة وجيزة مرتين باستخدام NTMT. بعد التهجين في الموقع ، شطف الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة.
اغمر الأجنة في 5٪ سكروز في برنامج تلفزيوني طوال الليل لمدة 12 إلى 14 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتغيير المحلول الذي يغطي الأجنة إلى 15٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضانه طوال الليل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند أربع درجات مئوية. مرة أخرى ، قم بتغيير المحلول الذي يغطي الأجنة إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضانه لمدة يوم إلى يومين عند أربع درجات مئوية.
انقل الأجنة إلى جهاز تبريد جديد للأنسجة واملأه برفق بوسط درجة حرارة القطع الأمثل مع تجنب تكوين الفقاعات. بعد ذلك ، قم بتقطيع العينات إلى أقسام بسمك 12 إلى 20 ميكرومتر باستخدام cryostat ونقل الأقسام بسرعة إلى شرائح زجاجية. اسمح للعينات بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتخزين الأقسام في صندوق منزلق مغلق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها لاحقا.
اغسل الشرائح التي تحتوي على الأقسام باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشرائح في المخزن المؤقت وقم بتسخين المحلول لمدة 20 دقيقة تقريبا لإبقائه بالقرب من درجة حرارة الغليان. استنزاف المحلول الزائد وجفف المنطقة المحيطة بكل قسم بعناية بقطعة من الأنسجة.
بعد ذلك ، ارسم دائرة حول القسم بقلم طارد للماء لتشكيل حاجز كاره للماء وسد القسم لمدة ساعتين في حجب المحلول -2 في درجة حرارة الغرفة. ماصة محلول الأجسام المضادة الأولية لكل شريحة واحتضان الشرائح في مربع رطب المناعي الكيميائي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني أثناء الحضانة لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة ، واستنزاف PBS الزائد.
ثم ، احتضان الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي المناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. مرة أخرى ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني أثناء الحضانة لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة ، واستنزاف PBS الزائد. بعد ذلك ، ماصة وسيط التثبيت على الشريحة وتركيبها بغطاء منزلق.
تم الكشف عن التعبير عن مستقبلات 5-HT2C في الجهاز العصبي المركزي في خط foxP2 egfp-caax المعدل وراثيا. لوحظ التعبير المتزامن ل 5-HT2C في الخط المعدل وراثيا مع الخلايا العصبية foxP2 ، والتي تم تصنيفها بواسطة بروتين الفلوريسئين الأخضر الفلوري. تم الكشف عن التعبير عن insm1a ، وهو عامل نسخ إصبع الزنك في الحبل الشوكي الزرد والخلايا العصبية الحركية ، في الخط المعدل وراثيا.
لوحظ التعبير المتزامن ل insm1a في الخط المعدل وراثيا مع الخلايا العصبية hb9 ، والتي تم تصنيفها بواسطة بروتين الفلورسنت الأخضر الفلوريسين. يجب تثبيت الزرد مع بارافورمالدهايد الطازج.
