إن فهم كيفية تطور الخلايا النجمية وتأسيسها لمورفولوجيتها المعقدة أمر ضروري لفهم كيفية تطور الدماغ ووظائفه. يصف هذا البروتوكول كيفية تحليل الجوانب الرئيسية لمورفولوجيا الخلايا النجمية في أنسجة المخ. يستخدم هذا البروتوكول رمزا مخصصا لقياس حجم منطقة الخلايا النجمية في أقسام الأنسجة السميكة.
يمكن أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لقياس مقدار تداخل الأراضي بين الخلايا النجمية المجاورة. من خلال الجمع بين هذا البروتوكول والتلاعب الجيني بالخلايا النجمية ، يمكن للباحثين التحقيق مباشرة في دور بروتينات ومسارات محددة في تطوير الخلايا النجمية والتفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا النجمية للبدء ، قم بإعداد حل جديد من TBST عن طريق إضافة 1 ملليلتر من 10٪ Triton X إلى أنبوب 50 ملليلتر وملء الأنبوب إلى 50 ملليلتر ب TBS. قم بإعداد 2 ملليلتر من حلول الحجب والأجسام المضادة لكل دماغ عن طريق الجمع بين مصل الماعز و TBST في أنبوب 15 ملليلتر.
بعد ذلك ، قم بتسمية لوحة من 24 بئرا لوضع عينات مختلفة في صفوف مختلفة في حلول مختلفة في أعمدة مختلفة ، ثم أضف ملليلتر واحد من TBST إلى الأعمدة الثلاثة الأولى التي تحمل علامة wash 1 و wash 2 و wash 3 ، وأضف 1 ملليلتر من محلول الحجب إلى العمود الرابع. قم بإعداد معول زجاجي عن طريق إذابة نهاية ماصة باستور مقاس 5.75 بوصة في خطاف صغير باستخدام موقد بنسن ، ثم انقل مقاطع الأنسجة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى عمود الغسيل 1 من لوحة 24 بئرا باستخدام المعول ، ثم اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق لكل منها في الغسيل 1 ، 2 ، و 3 آبار باستخدام الالتقاط الزجاجي لنقل الأقسام من بئر إلى آخر ، تليها احتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في محلول الحظر. تحضير q ملليلتر من محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق إضافة الجسم المضاد إلى محلول الأجسام المضادة ، ثم دوامة لفترة وجيزة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في أكبر من أو يساوي 4،000 مرة غرام عند 4 درجات مئوية.
بعد ذلك ، احتضن الأقسام في الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 إلى 3 ليال عند 4 درجات مئوية أثناء الاهتزاز. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بشفط اليوم 1 TBST من آبار الغسيل ، ثم أضف 1 ملليلتر من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا وانقل الأقسام إلى الغسيل الأول جيدا. بعد ذلك ، احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، قم بشفط اليوم-2 TBST من آبار الغسيل ، ثم أضف 1 ملليلتر من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا وانقل الأقسام إلى الغسيل الأول جيدا. أثناء الغسيل النهائي ، أخرج وسائط التركيب من 4 درجات مئوية واتركها تدفئ إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإعداد خليط من 2 إلى 1 من TBS والماء منزوع الأيونات وأضفه إلى طبق بتري. بعد ذلك ، قم بإعداد شريحة مجهرية بإضافة 800 ميكرولتر من خليط 2 إلى 1 من TBS والماء منزوع الأيونات إلى السطح.
انقل الأقسام من الغسيل 3 جيدا إلى طبق بتري ، ثم باستخدام فرشاة طلاء دقيقة ، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى من طبق بتري إلى السائل الموجود على الشريحة. بعد ذلك ، رتب الأقسام بعناية بحيث تكون مسطحة على الشريحة باستخدام فرشاة الطلاء. بعناية ، قم بإزالة السائل الزائد من الشريحة باستخدام ماصة P-1000 ، متبوعة بشفط الفراغ.
بمجرد إزالة كل السائل الزائد من الشريحة ، استخدم ماصة نقل لإضافة 1 قطرة من وسائط التركيب على الفور إلى كل قسم ووضع انزلاق غطاء برفق فوق الشريحة. اسمح لوسائط التركيب بالانتشار لبضع دقائق ثم قم بإزالة أي وسائط تركيب زائدة تخرج من تحت الغطاء عن طريق الشفط الفراغي. بعد ذلك ، قم بإغلاق جميع الحواف الأربعة للغطاء باستخدام طلاء أظافر شفاف.
اترك الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتخزينها بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية. باستخدام هدف 10x ، حدد موقع الخلايا الفردية للتصوير ولاحظ منطقة الدماغ المحددة أو المنطقة الفرعية ذات الصلة بالتجربة ، ثم باستخدام مقبض التركيز البؤري ، حدد ما إذا كانت الخلايا النجمية بأكملها موجودة داخل القسم. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى هدف زيت تكبير أعلى وجعل الخلية في بؤرة التركيز.
أثناء النظر من خلال قطعة العين ، استخدم مقبض التركيز البؤري للانتقال من أعلى الخلية إلى أسفلها ، ثم افحص الخلية بصريا للتأكد من احتواء الخلية بأكملها داخل القسم. باستخدام برنامج الاستحواذ المرتبط بالمجاهر البؤرية ، اضبط معلمات الاكتساب للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة ومستوى من التفاصيل ، ثم استخدم تكبير/تصغير 2x لهدف 40x ولا يوجد تكبير إذا كنت تستخدم هدفا 60x أو 63x. اضبط الحدود العلوية والسفلية للمكدس Z بحجم خطوة يبلغ 0.5 ميكرومتر لضمان التقاط الخلايا النجمية بأكملها باستخدام الصور الأولى والأخيرة دون أي وسم فلورسنت للخلية.
قبل البدء في التحليل ، قم بتثبيت ملف امتداد الهيكل المحدب ، XtspotsConvexHull ، عن طريق لصق الملف في المجلد الفرعي rtmatlab من مجلد XT. باستخدام محول ملفات Imaris ، قم بتحويل الصور إلى تنسيق IMS. بعد ذلك ، افتح ملف صورة في برنامج تحليل الصور وحدد زر 3D View لعرض الصورة في وضع 3D ، مما يضمن أن الخلية تفي بمعايير التضمين.
لإنشاء سطح، انقر على أيقونة إضافة أسطح جديدة باللون الأزرق، ثم قم بإنشاء منطقة ذات أهمية حول الخلية عن طريق إدخال الأبعاد في المربعات تحت حجم أداة إنشاء السطح أو سحب حواف المربع الأصفر. بعد ذلك ، اضبط الكثافة المطلقة للعتبة عن طريق سحب الشريط الأصفر أو إدخال القيم في المربع بحيث يملأ السطح الرمادي أكبر قدر ممكن من إشارة الخلية دون تجاوز حدود الخلية. بعد ذلك ، انقر فوق السهم الأخضر لإنهاء توليد السطح.
افحص السطح الذي تم إنشاؤه حديثا بعناية واحذف أي قطع سطحية ليست جزءا من الخلية عن طريق تحديدها ، ثم انقر فوق أداة تحرير القلم الرصاص متبوعة بخيار حذف. لتوحيد القطع السطحية المتبقية ، انقر فوق أيقونة مرشح القمع لتحديد الكل ، ثم انقر فوق أيقونة تحرير القلم الرصاص وحدد خيار توحيد. انقر فوق أيقونة إضافة بقع جديدة برتقالية وحدد قناة المصدر الصحيحة من القائمة المنسدلة ، ثم أدخل قيمة قطر XY المقدرة ب 0.400 ميكرومتر في المربع.
بعد ذلك ، انقر فوق السهم الأخضر لإنهاء إنشاء البقع ، ثم أعد تحديد البقع. انقر فوق أيقونة التصفية وحدد أقصر مسافة إلى الأسطح الأسطح X حيث الأسطح X هي السطح الذي يتم تحليله من القائمة المنسدلة، مما يضمن أن يكون كل من زري طاقة العتبة الدنيا والعتبة العليا أخضرين. بعد ذلك ، أدخل مسافة لا تقل عن 1.0 ميكرومتر في مربع العتبة السفلية ومسافة قصوى تبلغ 0.1 ميكرومتر في مربع العتبة العليا ، ثم انقر فوق الزر قسم مكرر إلى بقع جديدة ، مما يضمن تحديد البقع التي تم إنشاؤها حديثا في اللوحة العلوية اليسرى من نافذة البرنامج.
بعد ذلك ، انقر فوق رمز Gear Tools ، ثم انقر فوق المكون الإضافي Convex Hull مرة واحدة فقط وانتظر حتى تظهر نافذة MATLAB ثم تختفي مما يؤدي إلى هيكل صلب في عرض 3D. في اللوحة العلوية اليمنى ، تأكد من تحديد الهيكل المحدب للبقع X ، أقصر مسافة حيث تحديد البقع X هو تحديد البقع التي تم إنشاؤها حديثا ثم انقر فوق الهيكل لتحديده. بعد ذلك ، انقر فوق رمز إحصائيات الرسم البياني.
في علامة التبويب تحديد، تأكد من تحديد قيم محددة من القائمة المنسدلة العلوية ثم اختر مستوى الصوت من القائمة المنسدلة السفلية، ثم قم بتسجيل حجم الهيكل وحفظ الملف، وانتقل إلى الصورة التالية. تم قياس حجم منطقة الخلايا النجمية في الخلايا النجمية التي تعبر عن بروتين فلورسنت أحمر يستهدف الغشاء. ضربة قاضية من جزيء التصاق الخلايا الغنية بالخلايا النجمية ، hepaCAM ، يقلل بشكل كبير من حجم منطقة الخلايا النجمية.
تم استخدام تحليل الفسيفساء مع علامات مزدوجة لتوليد الفئران حيث تعبر الخلايا النجمية من النوع البري عن بروتين الفلورسنت الأحمر والخلايا النجمية الضربة القاضية الكبدية الكبدية عن بروتين الفلورسنت الأخضر. تم حساب النسبة المئوية لتداخل الأراضي بين أزواج الخلايا النجمية المجاورة للبروتين الفلوري الأحمر والأخضر. أظهرت الفئران التي لديها تعديل وراثي للكبد والخلايا النجمية الخضراء زيادة كبيرة في نسبة تداخل الأراضي مع جيرانها من النوع البري الأحمر مقارنة بأزواج الخلايا النجمية من النوع البري فقط.
توضح هذه النتيجة أن hepaCAM مطلوب لحجم أراضي الخلايا النجمية الطبيعي ، وتبليط الخلايا النجمية. من الأهمية بمكان التأكد من أن الخلية تفي بمعايير التضمين. سيكون للخلية غير المكتملة حجم منطقة أصغر وقد تؤثر على نتائجك واستنتاجاتك الإجمالية.
