نقدم بروتوكولًا لإعداد ثقافات شريحة عائمة مجانية من أنسجة الدماغ التي تم جمعها من المتبرعين البشريين الأحياء المقدمة لجراحة الدماغ التي يعاد تجديدها. هذه الثقافة هي قابلة لإجراء البيوكيميائية والخلايا البيولوجيا المقايسة أو الكيمياء المناعية. ومن المتوقع أن يسهم في توضيح الآلية الكامنة في التنكس العصبي في أمراض الدماغ المرتبطة بها.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه بديل أبسط وفعالة من حيث التكلفة لاتفاقية ثقافة الشريحة الكلاسيكية باستخدام إدراج الأغشية. على الرغم من أن البروتوكول العام ليس معقدًا ، إلا أن بعض الخطوات مثل إزالة السحايا ، وإلتصاق الأنسجة على قرص العينة الاهتزازية ، والاستئصال للكيمياء المناعية هي أفضل مفهومة عند إظهارها بصريًا. المساعدة في إثبات الإجراء ستكون نيلي مينديز وغلاوشيا الوسائطيا الذين هم طلاب غراد، وجيوفانا نوغيرا، طالبة غراد أخرى.
لبدء هذا الإجراء، إضافة الملح إلى دلو من الثلج. نقل الحل تشريح لهذا دلو والسماح لها بقية تحت خليط كاربوجين محتدما لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بعد ذلك، إعداد كتلة من 3٪ agarose التي هي حوالي سنتيمترين في سنتيمترين في سنتيمترين.
سوبر الغراء كتلة agarose إلى قرص عينة اهتزازي من أجل خلق دعم ميكانيكي إضافي لعينة الأنسجة أثناء التقطيع. على هزاز، تعيين سمك القسم إلى 200 ميكرومتر، وتردد الاهتزاز إلى 100 هرتز، واختيار سرعة تقطيع بين 0.5 و 1.0 ملليمتر في الثانية الواحدة. ثم قفل علبة العازلة هزاز إلى قاعدة هزاز وإضافة الجليد للحفاظ على المبردة قبل تلقي الحل تشريح والعينة وطوال الإجراء تشريح.
أولاً، إنشاء جهاز نقل يتكون من أسطوانة غاز محمولة تحتوي على خليط كاربوجين متصل بصمام تدفق الضغط الذي يتحكم في إنتاج الغاز المتصل بمواد السيليكون التي تربط ذلك الناتج من الغاز بسفينة النقل وسفينة النقل التي تحتوي على محلول النقل والجليد لعينة التبريد أثناء النقل. جمع ونقل العينة والنقل على النحو المبين في بروتوكول النص. نقل العينة إلى طبق بيتري التي تحتوي على حل تقطيع.
باستخدام أدوات جراحية دقيقة، وإزالة بعناية أكبر قدر من السحانيات المتبقية ممكن. اختيار أفضل اتجاه عينة لإنتاج شرائح مع خصائص معينة من تصميم تجريبي واستخدام عدد 24 شفرة مشرط لتقليم سطح مستو لتكون القاعدة التي سيتم لصقها على القرص العينة. باستخدام ملعقة بلاستيكية التخلص وفرش الطلاء الحساسة، وجمع جزء من طبق بيتري وتجفيف حل الزائدة مع ورقة مرشح.
بعد ذلك ، استخدم الغراء الفائق لإرفاق الأنسجة بطبق العينة الهزاز حتى يتم الالتزام به بقوة مع الطبق وعلى اتصال مع كتلة agarose. ضع قرص العينة الاهتزازية في علبة العازلة الاهتزازية. قفل حامل السكين في مكان مع شفرة الحلاقة ثابتة بحزم.
إضافة حل تشريح والتأكد من أنه يغطي كلا من العينة ونصلة. ثم تبدأ تشريح العينة إلى شرائح 200 ميكرومتر. نقل شرائح من علبة العازلة إلى طبق بيتري التي تحتوي على حل تشريح وتقليم أي حواف فضفاضة و الزائدة المادة البيضاء إلى نسبة من قشرة تقريبا 70٪ و 30٪ المادة البيضاء.
في مجلس الوزراء تدفق لارينار، إضافة 600 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة لكل بئر من لوحة 24-جيدا واحتضان في 36 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل طلاء الشرائح. بعد هذا، استخدم فرشاة لطلاء شريحة واحدة في كل بئر. إذا كان هناك أي آبار غير مستخدمة في لوحة، تعبئة لهم مع 400 ميكرولترات من الماء المعقم.
احتضان في 36 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تكملة 10 ملليلتر من المتوسط ثقافة أعدت سابقا مع الدماغ مشتقة عامل التغذية العصبية بتركيز 50 نانوغرام لكل ملليلتر. بعد ثماني إلى 16 ساعة، وإزالة 333 ميكرولترات من المتوسطة مكيفة من كل بئر وإضافة 133 ميكرولترات من BDNF جديدة تكمل المتوسطة.
استبدل ثلث الوسط المُكيف بـ BDNF الطازجة المُكملة كل 24 ساعة. أولاً، نقل الشرائح من الآبار التي تحتوي على الاستزراع المتوسط إلى لوحة جديدة تحتوي على 24 بئراً تحتوي على برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني من كل بئر واستبداله بميليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde.
احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة بعناية شبهformaldehyde من الآبار واستبدالها مع ملليلتر واحد من محلول السكروز 30٪. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
بعد 48 ساعة، تعيين microtome تجميد إلى درجة مئوية سلبية 40. إعداد قاعدة السكروز على مرحلة microtome حيث ينبغي وضع شرائح. بعد تجميدها تماما، وقطع بعض السكروز المجمدة لإنتاج سطح مستو الذي سيتم وضع شريحة.
بعد ذلك، ضع كل شريحة على فيلم بلاستيكي ممتد واستخدم فرشاة طلاء لتسطيح الأنسجة. في خطوة واحدة، نقل شريحة امتدت إلى قاعدة السكروز المجمدة. بعد أن يستريح شريحة لمدة خمس إلى 10 دقائق لتجميد بشكل صحيح، وقطع شريحة إلى 30 أقسام ميكرومتر.
نقل أقسام ميكرومتر 30 إلى طبق بيتري التي تحتوي على برنامج تلفزيوني والمضي قدما في بروتوكول الأنسجة كافية للتصميم التجريبي. عند تحديد نوعية وصحة الشرائح المستزرعة ، وهو جانب حاسم لتقييم وجود ومورفولوجيا نموذجية من أنواع الخلايا العصبية المتوقعة ، والخلايا العصبية والخلايا الدبقية. ويلاحظ أن العمارة النموذجية لل التصفيح القشري البشري في شريحة في اليوم في المختبر أربعة كشفت عن طريق المناعة العصبية.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا الوجود المتوقع من microglia و astroglia. هذه النتائج تثبت أن الأنسجة لا تتأثر بشكل كبير لا من قبل العملية الجراحية، وتجهيز العينة، أو الفترة القصيرة الأجل في المختبر. كما تم تحديد كمية استجابة الخلايا العصبية لتكبيد كلوريد البوتاسيوم الناجم عن ذلك في الشرائح المستزرعة باتباع فوسفوريل ERK.
ومن المثير للاهتمام، وينظر إلى زيادة واضحة في الفوسفور ERK في شرائح كلوريد البوتاسيوم المعالجة في اليوم في المختبر أربعة. وأخيرا، يتم تقييم استجابة شرائح في اليوم في المختبر أربعة إلى التحدي السامة مع المعروف الإجهاد التأكسي بيروكسيد الهيدروجين. وأدى تعريض الشرائح إلى بيروكسيد الهيدروجين 300 ملليمولر لمدة 24 ساعة إلى انخفاض قوي في الحد من MTT.
معا، وفاة الخلايا الضخمة لوحظت في اليوم في المختبر خمس شرائح بعد تحدي بيروكسيد الهيدروجين ونتائج إزالة القطب الناجمة عن كلوريد البوتاسيوم تشير إلى الحفاظ على الصحة العامة لشرائح في اليوم في المختبر أربعة التي تستجيب للمحفزات السامة مثل الإجهاد التأكسي. ويخصص هذا البروتوكول أساسا لدراسات تستند إلى مقايسات تستمر أكثر من أسبوع واحد مثل التحقيق في الآليات الجزيئية لإكسيالية الأعصاب والاعصاب من قبل الأدوية المرشحة. على الرغم من أن هذا البروتوكول مخصص لاستخدام الأنسجة القشرية التي تم جمعها من المرضى الذين تم تقديمهم للعلاج الجراحي من صرع الفص الصدغي المقاوم للصغرى ، فمن المرجح أن الأنسجة التي تم جمعها من مناطق الدماغ الأخرى أو الظروف يمكن أن تكون أيضًا مصادر لإنتاج ثقافات شريحة عائمة حرة.
قد تكون الثقافات شريحة من الدماغ البشري الكبار المفتاح في تعزيز فهمنا للأمراض العصبية البشرية بسبب الدوائر الخلوية الفريدة والآلات الجزيئية التي تفتقر إلى شرائح تنتج من أدمغة القوارض.
