يتم تشغيل تشكل المبيضات البيض من خلال عدد لا يحصى من الإشارات البيئية. من خلال دراسة التشكل في الجسم الحي ، نحدد كيف يتكامل الكائن الحي مع كل هذه الإشارات البيئية ويستجيب لها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بدراسة التشكل في غياب التحيز أو القطع الأثرية التي يمكن إدخالها باستخدام أنظمة النماذج في المختبر.
عدد قليل جدا من الناس لديهم خبرة في الحقن داخل الأدمة. أوصي بشدة أن يقوم شخص جديد على هذه التقنية بالاتصال بالطبيب البيطري للموارد الحيوانية للمساعدة في تعلمها. سيتم توضيح الإجراء روهان واكادي ، زميل ما بعد الدكتوراه من مجموعة مختبراتنا.
ابدأ بإعداد الحيوان للتلقيح عن طريق إطعام تشاو خال من الكلوروفيل لمدة سبعة أيام على الأقل قبل التلقيح. قبل يوم واحد من الحقن ، خذ القليل من خلايا كندا البيض من مستعمرة واحدة باستخدام مسواك. تلقيح 25 ملليلتر من YPD وكرر هذه العملية عدة مرات للحصول على خلايا من عدة مستعمرات مختلفة.
احتضان الاستزراع طوال الليل عند 30 درجة مئوية في حاضنة شاكر مدارية بسرعة 175 دورة في الدقيقة. جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من الثقافة لمدة دقيقتين عند 500 × جم ، ثم اغسل الخميرة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من DPBS المعقمة. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من DPBS المعقم وقم بتخفيف الثقافة من 1 إلى 100.
عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وبالتالي ضبط كثافة الخلية. بعد ذلك ، قم بإنشاء اللقاح للحقن عن طريق خلط كميات متساوية من السلالة المشار إليها والتجريبية. باستخدام مسحة قطنية ، ضع كريم مزيل الشعر الذي لا يحتاج إلى وصفة طبية بحرية على السطح الداخلي والخارجي لكلتا أذني مخدر.
بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، امسح الأذن برفق بشاش جاف متبوعا بضمادات شاش مشبعة بالماء المعقم لإزالة بقايا كريم مزيل الشعر تماما. بعد تعقيم سطح الأذنين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، امزج اللقاح جيدا عن طريق قلب القارورة عدة مرات أو دوامتها. ارسم 20 إلى 30 ميكرولترا من اللقاح في حقنة الأنسولين.
أمسك الإبرة في الوضع الرأسي واضغط على المحقنة برفق للتأكد من أن أي هواء في البرميل في الأعلى. أخرج الهواء واللقاح الزائد بعناية مرة أخرى إلى أنبوب اللقاح أو أنبوب النفايات بحيث يكون المكبس عند علامة 10 ميكرولتر. ضع الشريط الجلدي على الوجهين على أنبوب بلاستيكي صغير مخروطي أو مستدير القاع وقم بثني الأذن عبر الشريط ، وتجنب إزاحة مخروط أنف التخدير.
الحفاظ على إبرة المحقنة موازية تقريبا للجلد وتجنب أي عروق كبيرة ، أدخل طرف الإبرة في الطبقة الخارجية من الجلد حتى يتم تغطية شطبة فقط وحقن اللقاح ببطء داخل الأدمة. الحقن الجيد داخل الأدمة سيرفع فقاعة صغيرة في الجلد. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 15 إلى 20 ثانية قبل إزالتها من الأذن لتقليل التسرب.
باتباع البروتوكولات المؤسسية ، ضع علامة على القفص بملصقات بيولوجية تشير إلى أن الحيوانات الموجودة في القفص مصابة بالمبيضات البيض. باستخدام نفس المزارع المغسولة التي تم استخدامها لإعداد اللقاح ، قم بإنشاء تخفيف من 1 إلى 50 من الخلايا في RPMI 1640 ، مع استكماله بحرارة 10٪ ومصل بقري جنيني منشط واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الهبوط لمدة أربع ساعات. افحص العينة باستخدام المجهر.
عد ما لا يقل عن 100 خلية ، وسجل عدد الخميرة والخلايا الخيطية لكل سلالة. قم بتدوير هدف مسافة العمل الطويلة في مكانه وضع قطرة من سائل الغمر على العدسة. اخفض العدسة لتجنب التلف المحتمل عند وضع الغطاء المنزلق.
ضع الغطاء رقم 1.5 فوق فتحة المسرح وقم بتثبيته في مكانه. ارفع الهدف بحيث يكون سائل الغمر ملامسا لكل من العدسة الشيئية وانزلاق الغطاء. قم بتأمين مخروط أنف التخدير على مرحلة المجهر بطريقة تغطي أنف الحيوان بالكامل عندما يكون في وضع التصوير.
ضع أنف الفأر المخدر في مخروط الأنف. ضع قطرة من الماء المعقم على الغطاء فوق العدسة الشيئية. اضبط مخروط أنف التخدير وضع الماوس بحيث تكون أذن الفأر فوق قطرة الماء.
خذ زلة غطاء أخرى وضع حافة زلة الغطاء موازية لجسم الماوس بحيث تلامس الحافة الماوس حيث تلتقي الأذن بالرأس. باستخدام حركة مفصلية ، قم بخفض الحافة الحرة لانزلاق الغطاء إلى مرحلة المجهر. عندما يأتي انزلاق الغطاء ضد مرحلة المجهر ، فإنه سوف يسطح الأذن.
قم بربط الغطاء العلوي بإحكام لتحمل ضغطا كافيا للحفاظ على الأذن مسطحة وتجنب التقاط شعر الماوس أو شعيراته في الشريط. ما لم يتم استخدام مجهر مع غرفة بيئية ، قم بتغطية جسم الفأر بشكل فضفاض بستارة معقمة للحفاظ على بيئة حرارية طبيعية. باستخدام الضوء الأبيض ، والتصوير واسع المجال ، اضبط مستوى التركيز في أنسجة الأذن وركز على خلايا الدم الحمراء التي تتحرك في الأوعية الدموية.
للحصول على إشارة قوية بما يكفي لنسبة الضوضاء بحيث يمكن تحديد التشكل لجميع الخلايا في مجال الرؤية ، اضبط قوة الليزر أو سرعة التصوير. لتجنب تلف الأنسجة ، استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة. اختر مجال رؤية به تكوين خيوط واضحة في السلالة المشار إليها وحيث تنتشر معظم الكائنات الحية بدرجة كافية بحيث يمكن تحديد مورفولوجيتها.
اضبط مستويي التركيز العلوي والسفلي لمكدس Z. ليس من الضروري تغطية عمق المنطقة المصابة بالكامل ، ولكن ضع في اعتبارك أن الكائنات الحية في أعلى أو أسفل الحجم المصور عادة ما يتم استبعادها من التحليل. احصل على صور Z-stack ، وقم بتلوين كل قناة زائفة لتمييز كل سلالة وتراكب القنوات.
احفظ الصور. استخدم برنامج التصوير لإجراء أقصى إسقاط لمكدس Z في صورة ثنائية الأبعاد. عد كل كائن حي يظهر في صور الإسقاط القصوى حسب نوع السلالة والمورفولوجيا.
تشكل السلالة المشار إليها بسرعة خيوطا في المختبر. في حين فشل EFG1 Null في تشكيل خيوط. يظهر EFG1 Null عيبا كبيرا في الفتيل في الجسم الحي أيضا.
نما ما يقرب من 9٪ من خلايا EFG1 Null كخيوط في الجسم الحي. وبالمثل ، أظهرت سلالة CYR1 Null الطافرة عيبا في الفتيل في المختبر مقارنة بالسلالة المشار إليها. في المقابل ، نمت 53٪ من الخلايا الطافرة CYR1 Null كخيوط في الجسم الحي.
كانت الخيوط التي شكلتها طفرة CYR1 Null أقصر من السلالة المشار إليها. من الأهمية بمكان إبقاء الإبرة موازية للجلد أثناء التلقيح. الهدف هو وضع اللقاح تحت الطبقة الخارجية من الجلد.
يمكن أيضا استخدام هذه التقنية مع سلالات الفئران التي تعبر عن بروتين فلوري في الخلايا المضيفة ذات الأهمية مما يسمح لنا بدراسة تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة في الجسم الحي.
