نشكر لي Tuddenham (IBMC، ستراسبورغ) لتضخيم والمعايرة MCMV لوك وتوماس Baumert (INSERM U748، ستراسبورغ) للحصول على إذن لاستخدام مرفق الحيوان من معهد علم الفيروسات. ومن المسلم به الدعم المالي من INSERM، جامعة ستراسبورغ والوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-08-سحنة-005-01). ومن المسلم به أيضا بمشاركة الأولي من سونيا Beroud واتيتيا Lelieur خلال مشروع سيدهم.

1. إعداد تعليق الفيروسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على سلالة سميث من MCMV luciferase المراسل التعبير (MCMV لوك 15) من مختبر أولريش Koszninowski لل. في هذا المؤتلف، يتم إدراج الجين luciferase المراسل في موضع IE2 من الجينوم MCMV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتضخيم MCMV لوك، تصيب نخاع العظم خط خلية انسجة الفئران (M2-10B4، آي تي سي سي # CRL-1972) مع MCMV في تعدد مختلفة من العدوى (وزارة الداخلية، ،001-1) 16. لهذا، إضافة الفيروس إلى الخلايا المستزرعة في المتوسط ​​مجانا المصل عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة، وإزالة طاف واستبدالها مع DMEM تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS). بعد خمسة أيام، والحصاد ثقافة المتوسط ​​ومأخوذة تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعايرة لتعليق الفيروسي بواسطة فحص اللوحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا 3T3 (آي تي ​​سي سي # CRL-1658) في 24 لوحة جيدا في 40،000 خلية / جيدا في 1 مل من DMEM تستكمل مع FCS 10٪ تحتوي على البنسلين (200 وحدة دولية / مل)، وsteptomycin (200 ملغ / مل)، واحتضان 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير التخفيفات المتسلسلة (10 -1 إلى 10 -8) من قسامة من MCMV التعليق في DMEM وتصيب الخلايا المستهدفة (3T3) مع 200 ميكرولتر من التخفيف بعد إزالة مستنبت الخلية. احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. إضافة 1 مل من أعلى متوسط ​​(DMEM 3٪ FCS، 2٪ (V / V) والجنتاميسين، و200 وحدة دولية / مل البنسلين، 200 ملغ / مل الستربتوميسين، 8 ز / L كاربوكسيميثيل السليلوز)، واحتضان 5 أيام في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر الفورمالديهايد بنسبة 10٪ (وينبغي أن يتم التخفيف من الفورمالديهايد مع الماء في غطاء الكيميائية لتجنب استنشاق السامة) إلى كل بئر، ويحتضنها 6 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة مستنبت + التبعي من قبل pipetting خارج وإضافة 200 ميكرولتر حل تلطيخ الخلية (1٪ الكريستال البنفسجي (W / V) في 20٪ من الإيثانول). قبل الاستخدام، تمييع 1 جزء مع 9 أجزاء من الماء ملي-Q. احتضان 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل لوحة 3-4X عن طريق نقع في الماء، واسمحوا الجافة وحساب عدد لويحات مع مجهر. </li></ol></li> &lt;لى&gt; تمييع MCMV لوك في DMEM للحصول على 50 PFUs في 50 ميكرولتر وترك على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى. باستخدام اللقاح الفيروسي أعلى يدفع الفتك قبل حديثي الولادة تصل إلى 2-3 أسابيع من العمر. في تجربتنا، 500 PFUs لحث على الفتك في كل الوليد 5-7 أيام بعد الحقن. </li></ol> 2. حقن من الولدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون حديثي الولادة (4-20 الفئران ساعة من العمر) المتاحة، معالجة القمامة والبراز من القفص مع قفازات قبل التعامل مع الجراء بعناية لتجنب التلوث مع الروائح &quot;الخارجية&quot; التي من شأنها أن نؤكد على الأم وتحفز على رفض الجراء . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء حقن داخل الصفاق باستخدام حقنة الانسولين (29 G) كما هو مبين في الشكل 1A. عقد الوليد مع الجلد الظهرية. مع الجانب بطني حتى، وإدخال الإبرة تحت الرجل الاماميه ودفع برفق تحت الجلد لتحقيق التجويف البريتوني (قليلا تحت السرة). نحن حقن حاليا 1٪ الميثيلين الأزرق المخفف في DPBS ورصد البقاء على قيد الحياة إلى فractice هذه التقنية قبل تنفيذ الالتهابات الفيروسية. منذ أزرق الميثيلين مرئيا بوضوح خلال عملية الحقن، ونحن نعتقد بأن تنفيذ هذا &quot;التدريب&quot; الحقنة الأولى أن يضمن تسليم مناسب من التعليق الفيروسية في تجويف داخل الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على قطرات الدم الصغيرة التي قد تنشأ، ووضع الظهر الوليد في القفص. </li></ol> 3. في الجسم الحي التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 7، والتعامل مع حديثي الولادة مع نفس تحذر كما ذكر سابقا. حقن الغشاء البريتونى خليط من أدوية التخدير (4 ملغ / مل الكيتامين، 0.8 ملغ / مل زيلازين) ووسيفيرين (0.15 ملغ / غرام من وزن الجسم) في 50 ميكرولتر في كل حيوان. متوسط ​​وزن الجسم من الحيوانات هو 1-2 ز وجرعة من أدوية التخدير للحيوان الواحد هو: الكيتامين 40 ميكروغرام، زيلازين 8 ميكروغرام انتظر 12-15 دقيقة حتى وسيفيرين تصل إلى الحد الأقصى من الانبعاثات. هذا يجب أن يتم تحديدها مسبقا ويعتمد على مزود وسيفيرين ونظام التصوير المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الجراء هي anesthetiزد، علامة عليها لتحديد المستقبل وحصاد قطعة صغيرة من الأنسجة التي يمكن استخدامها بعد ذلك لالتنميط الجيني في المستقبل إذا تم استخدام حيوانات متحولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجراء في نظام التصوير وأداء الاستحواذ على الضوء المنبعث من الجسم كله. سبعة أيام بعد الإصابة، وتكرار الفيروس في العديد من النسخ في الأجهزة المستهدفة مثل الكبد والكلى والرئتين والغدد اللعابية، وبالتالي، يتعين على مدة التعرض تكون قصيرة. في حالتنا، ونحن أداء اقتناء لمدة 10 إلى 20 ثانية (الشكل 1B). منصة في قاعة اقتناء جهاز التصوير يحتاج إلى أن يكون ساخنا لتجنب التبريد المفرط للدرجة حرارة الجسم من تخدير الحيوانات. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المفيد للحصول على صور منخفضة الدقة من العديد من الحيوانات ضمن جولة واحدة من اقتناء وبعد ذلك، نقل ما يصل منصة أقرب إلى عدسة الكاميرا من أجل التركيز على جزء واحد من حيوان معين أو جهازا معزولة في اعقاب تشريح. البرنامج يجب تمكين التغيرات السريعةمن المعلمات (زمن التعرض، وبعد المسافة عينة / عدسة، والحساسية)، الكمي من مناطق محددة من الفائدة والصادرات في المستقبل من الصور لقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على إشارة ضوئية من الرأس فقط، وتغطي الجسم من الولدان الكذب أفقيا مع سميكة، ورقة المظلمة التي سوف تحجب الفوتونات المنبعثة على مستوى الأجهزة حيث يحدث تكاثر الفيروس عالية (الكبد، الرئتين، الغدد اللعابية) وأداء اقتناء لمدة 5 إلى 10 دقيقة (الشكل 1C). أداء اكتساب الجانب بدلا من الحيوان في نفس الظروف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تقديم الجراء في قفص ووضع مصباح التدفئة على رأس لتجنب التبريد المفرط للتخدير حديثي الولادة. رصد الانتعاش بعد مخدر بانتظام. مع جرعة المشار إليه، والتخدير يستمر 30 دقيقة حاليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نفس الإجراء في أيام 9 و 11 و 14. في أيام 11 و 14، وتغيير جرعة من التخدير (6 ملغ / مل الكيتامين و 1.2 ملغ / مل زيلازين). </li></ol>

<ol>
	<li>Loewendorf, A., Benedict, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+and+adaptive+immune+defenses+by+cytomegalovirus:+timing+is+everything.">Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything.</a> J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).</li><li>Lischka, P., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+strategies+to+combat+cytomegalovirus+infections+in+transplant+recipients.">Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).</li><li>Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+cytomegalovirus+a+target+in+cancer+therapy?.">Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?.</a> Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).</li><li>Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+in+neonates.">Immunity in neonates.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).</li><li>Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+immunity:+faulty+T-helpers+and+the+shortcomings+of+dendritic+cells.">Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells.</a> Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).</li><li>Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responsiveness+in+the+neonatal+period.">Immune responsiveness in the neonatal period.</a> J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).</li><li>Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathogenesis+of+congenital+cytomegalovirus+infection:+disease+mechanisms+and+prospects+for+intervention.">Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).</li><li>Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytomegalovirus+infection+on+embryogenesis+and+brain+development.">Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development.</a> Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).</li><li>Sancho-Shimizu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+herpes+simplex+virus+1+encephalitis+in+mice+and+humans.">Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).</li><li>Crozat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+MCMV+resistome+by+ENU+mutagenesis.">Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis.</a> Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).</li><li>Juanjuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+congenital+CMV+infection+and+hearing+impairment.">Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment.</a> Virol. J. 8, 70 (2011).</li><li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system.">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li><li>Bantug, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة. بيان الأخلاق تمت المحافظة على الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض في منشأة رعاية الحيوان من معهد الدراسات Immunologie وآخرون D&#39;Hématologie. أجريت التعامل مع الفئران والإجراءات التجريبية وفقا للقانون الفرنسي لحماية الحيوانات في المختبر. تمت الموافقة على الإجراء من قبل خدمة véterinaire دي لا ولاية دو باس رين (فرنسا) تحت ترخيص رقم A-67-345.

باستخدام تكنولوجيا التصوير في الجسم الحي لرصد نشر MCMV لوك في الفئران حديثي الولادة، وكنا قادرين على مراقبة انتشار الفيروس إلى الدماغ من الحيوانات متحولة، في مقابل من النوع البري. وأكد مزيد من الحيوان والتصوير فيفو السابقين من تشريح الدماغ وجود فيروس الانار...

الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV/HHV-5) هو عضو في الأسرة β-هربس. HCMV هو واسع الانتشار، الممرض الانتهازية والتي عادة ما المكتسبة أثناء الحياة المبكرة باعتبارها عدوى عديمة الأعراض 1. مثل جميع فيروسات الهربس، HCMV استمرت طوال حياة كاملة من المضيف الذي تسيطر بإحكام تكاثر الفيروس الجهاز المناعي. حلقات تنشيط الفيروسية تحدث في الغالب في الأفراد المناعة مثل مرضى زرع يتلقون أدوية لمنع رفض الكسب غير المشروع 2. في البالغين، كما تم ربط HCMV إلى glioblastomas 3. وبالإضافة إلى ذلك، HCMV هو الممرض بارز لحديثي الولادة مع الحصانة غير ناضجة 4-6. العدوى الأولية في الجنين أو الوليد يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة. عدوى HCMV هو السبب المعدية الأكثر شيوعا من العيوب الخلقية واضطرابات الطفولة في البلدان المتقدمة. وتشير التقديرات إلى أن حالات الإصابة HCMV حديثي الولادة يؤثر 0.5-1٪ Oو كل ولادة حية بين 5-10٪ والتي سوف يعانون من أعراض حادة مثل صغر الرأس أو نقص تنسج مخيخي. وبالإضافة إلى ذلك، سوف 10٪ من الرضع المصابين بفيروس التهاب فيروسي تحت الإكلينيكي يتطور لاحقا sequellae مما يؤدي إلى التخلف العقلي، وفقدان، والعيوب البصرية أو الاستيلاء والصرع 7،8 السمع. وعلى عكس فيروس الهربس الإنسان الأخرى مثل الهربس البسيط 1 (HSV-1/HHV-1) والتي يمكن تلقيح الفئران إلى عبر طرق مختلفة من حقن 9، والنسخ الفيروس المضخم للخلايا هو أنواع محددة. هذه الميزة قد عرقل بشدة التحقيق في HCMV المرضية التي يتم تنفيذها في نماذج حيوانية مختلفة (الجرذان والفئران، خنزير غينيا، قرد هندي صغير) وCMVs المضيف محددة حقيقية لكل منها. جميع CMVs يحمل التشابه الكبير في حجم الجينوم والتنظيم، tropism الأنسجة وتنظيم التعبير الجيني. كما أنها تحفز أمراض مماثلة في المضيف كل منها. على الرغم من التنوع الجيني يكونتوين HCMV والفأر الفيروس المضخم للخلايا (MCMV) (50٪ من ORFS الموجودة في فيروس الإنسان والتي تم تحديدها في الفئران CMV)، وقد أثبت نموذج الفأر مؤخرا ليكون من المفيد، وذلك لأن معظمهم يمكن اختبار سلالات متحولة لقدرتها على السيطرة الفيروسية النسخ المتماثل في الجسم الحي. وقد أدى هذا إلى شاشة الوراثية التي مكنت تقدير لعدد من الجينات الماوس التي أعرب عنها في مرحلة الكبار الذي يؤلف &quot;resistome&quot; لهذا الفيروس 10. وإجمالا، يشير هذا إلى أن الفئران تمثل MCMV المصابة نموذجا جذابا لدراسة التفاعلات المضيف الفيروس لدى البالغين. استكشاف العدوى الخلقية CMV هو أكثر تعقيدا بسبب الاختلافات في منظمة طبقة المشيمة بين الإنسان والفئران تنال من انتقال العدوى من الأم إلى الطفل من عدوى فيروسية في الفئران. مؤخرا، الحقن المباشر للMCMV في المشيمة في يوم 12.5 من الحمل وقد مكن عدوى الدماغ من الفئران حديثي الولادة مما أدى إلى ضعف السمع 11. ومع ذلك، فإن معظم طnvestigations الآن استخدام حقن داخل الصفاق من 4-20 حديثي الولادة ساعة من العمر لتوفير نشر الفيروسية الجهازية مما قد يؤدي إلى عدوى الدماغ الدموي، وهذا نموذج والتي هي أكثر أهمية من أن وجود حقن داخل القحف. قدم هذا البروتوكول نظرة ثاقبة CMV المرضية وعلى الأخص، وقد تبين أن عدوى MCMV النتائج حديثي الولادة في تكاثر الفيروس في الخلايا العصبية والدبقية تقع في البؤر الالتهابية التي تسللت مع الخلايا وحيدات النوى مثل الضامة 12. وصف هذا التقرير أيضا التشكل غيرت من المخيخ ترافق مع تقلص انتشار الخلايا العصبية الحبيبية والهجرة وتحريض متعددة الجينات الإنترفيرون حفز. وأفيد أيضا بالدور الأساسي للCD8 + الخلايا التائية من أجل السيطرة على MCMV في الجهاز العصبي المركزي من قبل نفس المجموعة 13. أحد الجوانب الهامة التي يجب مراعاتها عند تحليل تأثير المرضية من جرثومة هو ديناميات تصيبأيون. في حالة MCMV، فمن الأهمية بمكان وخاصة لاستكشاف وتحديد تطور نشر الفيروسية في الدماغ النامية من أجل فهم وتوقع حجم الإصابات العصبية الحيوية في المستقبل. تقليديا، الكمي لتطور العدوى يتطلب التضحية العادية من الحيوانات المصابة إلى عيار الممرض في الأنسجة، مثل الدماغ، والتي لا يمكن الوصول إليها على خلاف ذلك. وتحدى هذا النوع من بروتوكول الآن من خلال التحسين اللازمة لرعاية الحيوان و3RS (الحد، حدد، استبدال) مبادئ 14. باستخدام تقنيات التصوير في الجسم الحي قد تسمح لانخفاض حاد في عدد الحيوانات التي هي ضرورية في التجارب العدوى في الجسم الحي. هنا، ونحن التقرير وصفا لتحليل الوقت طبعا من نشر الفيروسية في الدماغ على داخل الصفاق MCMV لوك الحقن لحديثي الولادة الماوس. باستخدام نفس الحيوانات، ونحن تعقب ورصد في الجسم الحي مواقع السادس مكثفةراؤول النسخ المتماثل خلال الفترة من 2 أسابيع.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV أو HHV-5) هو الممرض التي تهدد الحياة في الأفراد المناعة الشبهة. على العدوى الخلقية أو الأطفال حديثي الولادة، يمكن للفيروس أن يصيب وتكرار في الدماغ النامية، التي ربما تتسبب في أضرار عصبية شديدة، بما في ذلك الصمم والتخلف العقلي. وعلى الرغم من شدة المحتملة للأعراض، والخيارات العلاجية محدودة بسبب عدم توفر لقاح وغياب العلاج المضاد للفيروسات محددة. وعلاوة على ذلك، وصفا دقيقا من الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء إصابة الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تزال تفتقر منذ الملاحظات مستمدة في معظمها من تشريح الجثة من الأطفال المصابين. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية، مثل CMV المكاك ريسوس، وقدمت معلومات هامة عن CMV المرضية في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، على الرغم من التقارب التطوري مع البشر، وهذا النموذج كان محدودا قبل إجراء التلقيح داخل القحف استخدامها لتصيب الحيوانات وسلبياتلحث istently عدوى الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، عززت الاعتبارات الأخلاقية تطوير نماذج بديلة، من بين التي أدت عدوى حديثي الولادة من الفئران حديثي الولادة مع الفيروس المضخم للخلايا الفأر (MCMV) مؤخرا إلى التقدم الكبير. على سبيل المثال، أفيد أن الحقن داخل الصفاق من MCMV لحديثي الولادة BALB / ج يؤدي إلى إصابة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في مناطق معينة من الدماغ. اقترح هذه النتائج أن التلقيح التجريبية من الفئران قد ألخص العجز الناجم عن الإصابة HCMV في الأطفال. ومع ذلك، فإن التحليل الديناميكي للعدوى MCMV من حديثي الولادة من الصعب تنفيذ ذلك لأن المنهجية الكلاسيكية يتطلب التضحية من عدد كبير من الحيوانات في نقاط زمنية مختلفة لتحليل عبء الفيروسية و / أو المعلمات المناعية ذات الصلة. للتحايل على هذه عنق الزجاجة وتمكين التحقيقات المستقبل من الحيوانات متحولة نادرة، طبقنا في الجسم الحي تكنولوجيا التصوير لإجراء تحليل الوقت طبعا من فيرانشر لتر في الدماغ عند حقن الطرفية من MCMV المؤتلف معربا عن luciferase المراسل إلى C57BL / 6 حديثي الولادة.

ويتضح تجربة ممثل في الشكل 1. عند حقن داخل الصفاق من 50 PFUs من MCMV لوك (لوحة ويظهر حقنة مماثلة أجريت مع الميثيلين الأزرق لتصور الطريق تحت الجلد من الإبرة)، كان الولدان تخدير وردت في وقت واحد 0.3 ملغ من الركيزة luciferase المراسل (وسيفيرين، الفرجار). وبعد خمس عشرة دقيقة، و?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates at JoVE.com

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) إصابة حديثي الولادة يمثل أحد أهم أسباب التخلف العقلي، إلا أن الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى فيروس من صنع المرضية لا تزال غير مفهومة تماما. للتحقيق في ديناميات الإصابة في الدماغ، ونحن تكييفها كامل الحيوان<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير لإجراء تحليل الوقت طبعا من حديثي الولادة المصابين بفيروس وسيفيراز-المؤتلف.

استخدام<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير لرصد تطور التجريبية ماوس عدوى الفيروس المضخم للخلايا في حديثي الولادة

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

use-vivo-imaging-to-monitor-progression-experimental-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.9K Views.  Université de Strasbourg. الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) إصابة حديثي الولادة يمثل أحد أهم أسباب التخلف العقلي، إلا أن الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى فيروس من صنع المرضية لا تزال غير مفهومة تماما. للتحقيق في ديناميات الإصابة في الدماغ، ونحن تكييفها كامل الحيوان في الجسم الحي...

Video: Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

استخدام ثنائي الأسيتات Carboxyfluorescein Succinimidyl إستر (CFSE) لمراقبة انتشار الخلايا الليمفاوية

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

طريقتين لتشكيل متغايرة النوى إلى اكتشاف العوامل تقييد HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

تصوير إنتاج غاما للإنترفيرون في الموقع في طحال الفأر بعد عدوى الليستيريا أحادية الخلايا

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

استخدام

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي

استخدام ثنائي الأسيتات Carboxyfluorescein Succinimidyl إستر (CFSE) لمراقبة انتشار الخلايا الليمفاوية

استخدام متوسط البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة

طريقتين لتشكيل متغايرة النوى إلى اكتشاف العوامل تقييد HCV

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان

تصوير إنتاج غاما للإنترفيرون في الموقع في طحال الفأر بعد عدوى الليستيريا أحادية الخلايا

استخدام

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي

استخدام ثنائي الأسيتات Carboxyfluorescein Succinimidyl إستر (CFSE) لمراقبة انتشار الخلايا الليمفاوية

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة

طريقتين لتشكيل متغايرة النوى إلى اكتشاف العوامل تقييد HCV

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

في الجسم الحي أسلوب التصوير لتميز الالتهاب الحاد والمزمن

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان

تصوير إنتاج غاما للإنترفيرون في الموقع في طحال الفأر بعد عدوى الليستيريا أحادية الخلايا

استخدام متوسط البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة