يوفر هذا البروتوكول أداة مهمة لدراسة التفاعلات بين الخلايا المناعية المعوية والظهارة وتشريح كيفية تنظيم هذه التفاعلات في التوازن المعوي والالتهاب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكمية الرائعة من التحكم التجريبي الذي يسهله نموذج الاختزال في المختبر ، والذي يمكن استخدامه لمعالجة الأسئلة في البيولوجيا الظهارية والمناعية. وقد استخدم هذا النظام بالفعل لتحديد دور ILC1 في توسيع الخبايا الظهارية الإيجابية CD44 ولديه القدرة على زيادة تعزيز فهمنا لأمراض الجهاز الهضمي بوساطة الالتهاب.
للبدء ، ضع مصفوفة قاعدية خارج الخلية متقاطعة حرارية على الجليد لإذابة الجليد وتسخينها مسبقا صفيحة قياسية من 24 بئرا معالجة بالأنسجة عن طريق وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على عضويات من الحاضنة وتخلص من الوسائط من البئر المراد مرورها. ثم ، أضف 500 ميكرولتر من DMEM F12 المتقدم المثلج إلى الآبار ، وباستخدام طرف P-1000 ، قم بحصاد المواد العضوية من جميع الآبار في أنبوب 15 ملليلتر.
شطف قاع الآبار مع 250 إلى 300 ميكرولتر من DMEM F12 المتقدمة الباردة ، وضمان عدم بقاء أي عضويات في البئر وتجمع في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على المواد العضوية التي تم حصادها. أعد تعليق الكريات العضوية التي تم حصادها من يوم إلى يومين في ملليلتر واحد من DMEM F12 المتقدم في الجليد البارد. قبل تغطية أنبوب واحد 1.5 ملليلتر مع PBS2 لكل خلايا ليمفاوية فطرية تكرار العينة، ومن ثم باستخدام طرف PBS2 المغلفة مسبقا، وتوزيع ما يقرب من 100 إلى 200 العضوية في الأنبوب.
باستخدام طرف P-1000 المطلي ب PBS2 ، أضف حجما لا يقل عن 500 ILC1s كما هو محسوب من خطوة الفرز إلى أنبوب PBS2 المطلي ب 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على المواد العضوية. قم بتدوير ILC1 والمواد العضوية عند 300 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتأكد من تجنب أجهزة الطرد المركزي على الطاولة ذات القطر الصغير ، لأنها ستسحب الخلايا على طول حافة الأنبوب الداخلي بدلا من إنشاء حبيبة عند طرف الأنبوب. ثم ، قم بإزالة supernatant ببطء وبلطف دون إزعاج الكريات ووضع العينة على الجليد.
أثناء حمل الأنبوب على سطح بارد ، أعد تعليق المواد العضوية و ILC في 30 ميكرولتر من المصفوفة القاعدية خارج الخلية المتشابكة حراريا على الأقل من 10 إلى 15 مرة لضمان التوزيع المتساوي. ضع 30 ميكرولترا لكل بئر من المواد العضوية ILC في المصفوفة القاعدية خارج الخلية المتشابكة حراريا على صفيحة 24 أو 48 بئرا تم تسخينها مسبقا لتشكيل قبة واحدة. بعد ذلك ، ضع اللوحة مباشرة في الحاضنة لمدة 10 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
ثم أضف 550 ميكرولتر من وسط ILC1 الكامل لكل بئر مع أي سيتوكينات تجريبية مرغوبة أو أجسام مضادة مانعة واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة اللوحة بلطف من الحاضنة واسمح للصفيحة بالجلوس في غطاء زراعة الأنسجة لمدة دقيقة واحدة لضمان استقرار الخلايا الليمفاوية. قم بإزالة 200 إلى 250 ميكرولتر من الوسائط وضعها في بئر فارغ من لوحة 24 بئرا.
باستخدام المجهر المقلوب ، تحقق من supernatant للتأكد من عدم إزالة الخلايا الليمفاوية. إذا كان السوبرناتانت واضحا، أضف 300 ميكرولتر من وسط ILC1 الطازج إلى الثقافة المشتركة في البئر الأصلي. إذا كانت الخلايا الليمفاوية موجودة في السوبرناتانت ، فقم بجهاز طرد مركزي عند 300 إلى 400 جم لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من وسط ILC1 الطازج.
ثم ، أضف تعليق الخلية إلى 200 إلى 250 ميكرولتر المتبقية من الوسائط في البئر الأصلي. قم بإجراء تحليل المصب باستخدام التألق المناعي أو قياس التدفق الخلوي أو تنقية FACS للسكان المستهدفين في مخزن مؤقت للتحلل لتحليل التعبير الجيني بواسطة بحث الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو السائبة أو RT-qPCR كما هو موضح في النص. بعد الانتهاء بنجاح من المرور ، كشفت الثقافات العضوية الصحية والقوية أن الخبايا المعزولة حديثا يجب أن تشكل هياكل سراديب ناشئة في غضون يومين إلى أربعة أيام.
تم إجراء تحليل التدفق الخلوي لعزل ILC1 المعوي الصغير عن خط المراسل المعدل وراثيا ROR gamma-T murine ، ووجد أن نطاق تعداد ILC المتوقع يتراوح بين 350 و 3،500 خلية معزولة. بعد أن يتم زرعها مع المواد العضوية ، يمكن تصور الثقافات المشتركة بواسطة الكيمياء الخلوية المناعية. كشف الفحص المجهري البؤري عن صور عضويات معوية صغيرة يتم استزراعها بمفردها وفي وجود ILC1s.
يكشف التلطيخ المناعي الخلوي الكيميائي عن وجود ILC1 إيجابي CD45 على مقربة من الخلايا الظهارية الإيجابية للبروتين 1 في الثقافات العضوية ILC1. أظهر قياس التدفق الخلوي أن جزيء الالتصاق الخلوي الظهاري يشير إلى الخلايا الظهارية المعوية في المواد العضوية ، بينما يشير CD45 إلى ILC1s. كشفت مخطط التدفق الخلوي والكيمياء المناعية عن زيادة التعبير عن CD44 في الخلايا الظهارية المعوية عند زراعتها مع ILC1.
تظهر دراسات RT-qPCR أن الثقافة المشتركة ILC1 على وجه التحديد رفعت تنظيم CD44 البديل 6 ، الذي تم تثبيطه بواسطة TGF-beta 1 و 2 و 3 تحييد الأجسام المضادة ، وتم تنظيمه بواسطة TGF-beta 1 المؤتلف في الثقافات المعوية العضوية الصغيرة فقط. من المهم أن تكون لطيفا أثناء التلاعب بالمواد العضوية لضمان الحفاظ على الهياكل بأكملها والتحقق من أن الهياكل قد تم تكويرها بما فيه الكفاية بعد الطرد المركزي. من خلال زيادة تعقيد النظام عن طريق إضافة مكونات مناعية وغير مناعية أخرى ، يمكن استخدام هذا النظام في المختبر لمعالجة المزيد من الأسئلة في البيولوجيا المعوية.
