نود أن نعرب عن تقديرنا للسيدة براتشي شاه لمساعدتنا في البداية في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور مانوج جارج على توفير خط خلايا سرطان المبيض A2780. يتم دعم EK من خلال منحة بحثية من قسم التكنولوجيا الحيوية (رقم BT / RLF / Re-entry / 06/2015) ، وقسم العلوم والتكنولوجيا (ECR / 2018 / 002117) ، ومنحة NMIMS Seed Grant (IO 401405).

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول أدناه. ويدرج الجدول 1 الكواشف المصنوعة في المختبر إلى جانب الأحجام المحسنة، ويبين الجدول 2 تركيزات العمل من الكواشف المتاحة تجاريا.
1. ثقافة الخلية
<ol><li>الحفاظ على الخلايا التي سيتم قياس طول التيلومير الخاص بها (المستخدمة هنا كانت خلايا A2780 ، وهي خط خلايا غدية المبيض) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الوسط الكامل المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، والستربتومايسين ، والبنسلين ، والأمفوتريسين B في طبق بتري 6 سم. احتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة وخاضعة للرقابة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتجمع الخلايا بنسبة 80٪ -100٪.</li>
	<li>قم بإزالة الوسائط واغسلها ب 5 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).</li>
	<li>عالج الخلايا ب 1 مل من حمض التربسين والإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) لفصل الخلايا عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.</li>
	<li>أضف 2 مل من وسائط DMEM الكاملة لتعطيل التربسين وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي.</li>
	<li>حبيبات الخلايا في 2,348 × غرام لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>اغسل الحبيبات باستخدام 1x PBS وأجهزة طرد مركزي عند 2,348 × جم لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قم بتخزين الحبيبات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد الخلايا حسب خط الخلية. حصلنا على ما يقرب من 2.5 × 106 خلايا في حالة خط الخلايا A2780 ، والذي يستخدم في خطوات أخرى.</li>
</ol>2. عزل الحمض النووي الجينومي
<ol><li>أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل (10 مللي متر tris-Cl ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 25 مللي متر EDTA ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ؛ 0.5٪ وزن / فولت كبريتات دوديسيل الصوديوم) إلى حبيبات الخلية واخلطها برفق باستخدام طرف مقطوع (بقطر فتحة لا يقل عن 2 مم). أضف 20 ميكروغرام / مل من RNase A المحضر حديثا واخلطه برفق عن طريق الانقلاب.</li>
	<li>احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وأحيانا عكس الأنبوب أثناء الحضانة.</li>
	<li>أضف بروتيناز K إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل واخلطه برفق عن طريق الانعكاس 10 مرات. احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. اقلب الأنبوب على فترات منتظمة (كل 10 دقائق) أثناء الحضانة.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كاشف كحول الأيزو أميل (25:24:1) واخلطه برفق عن طريق الانقلاب 20 مرة. جهاز طرد مركزي عند 9391 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 درجة مئوية). ملاحظة: يوضح الشكل 1 أ الطبقات الثلاث التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي.</li>
	<li>قم بإزالة الطبقة المائية العلوية اللزجة من الطبقات الثلاث المرئية ، وضعها في أنبوب جديد باستخدام طرف مقطوع ، وأضف كمية متساوية من الكلوروفورم. تخلط بانعكاس لطيف 20 مرة.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 9391 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>اجمع الطبقة المائية وأضف كمية مناسبة من 5 M NaCl بحيث يكون التركيز النهائي لكلوريد الصوديوم 0.2 M.</li>
	<li>أضف مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪. تخلط عن طريق انعكاس لطيف 20-25 مرة. جهاز طرد مركزي عند 15,871 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ لغسل الحبيبات. أجهزة الطرد المركزي عند 15871 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية ، وجفف الحبيبات بالهواء لبضع دقائق ، وأضف 50 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النيوكلياز. اسمح للحمض النووي بإعادة الترطيب لمدة 1-2 أيام في درجة حرارة الغرفة. تخلط عن طريق السحب باستخدام طرف القطع.</li>
	<li>قياس تركيز الحمض النووي باستخدام قياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية (UV). قم بتخفيف العينات ، إذا لزم الأمر ، باستخدام ماء معقم خال من النيوكلياز للحصول على تركيز لا يقل عن 300-500 نانوغرام / ميكرولتر.</li>
	<li>تحقق من سلامة الحمض النووي عن طريق تشغيله على هلام أغاروز 1٪ (الشكل 1 ب).</li>
	<li>قم بتخزين الحمض النووي المخفف في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.</li>
</ol>3. هضم الحمض النووي الجينومي
<ol><li>تحضير خليط إنزيم من Rsa1 (20 U) و Hinf1 (20 U) وإضافة 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم التقييد لكل تفاعل.</li>
	<li>خذ حجما مناسبا من الحمض النووي الجينومي بحيث تكون الكمية الإجمالية للحمض النووي 1.5 ميكروغرام. قم بتكوين الحجم بماء معقم خال من النيوكلياز ، بحيث يكون الحجم الكلي بعد إضافة الإنزيم 20 ميكرولتر.</li>
	<li>تخلط جيدا عن طريق النقر ، تليها تدور النبض.</li>
	<li>احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.</li>
</ol>4. هلام الاغاروز الكهربائي
<ol><li>تحضير 10 سم × 15 سم 0.8٪ هلام الأغاروز في 1x ثلاثي خلات EDTA (TAE) العازلة باستخدام أغاروز عالية الجودة.</li>
	<li>أضف 5 ميكرولتر من صبغة التحميل إلى كل عينة من الحمض النووي الجينومي المهضوم ، مما يجعل الحجم النهائي 25 ميكرولتر ، وقم بتحميل العينات على الهلام.</li>
	<li>قم بإعداد مزيج الواسمات الجزيئية باستخدام 1 ميكرولتر من الواسمات الجزيئية (سلم) ، و 3 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من النيوكلياز ، و 1 ميكرولتر من صبغة التحميل 5x.</li>
	<li>قم بتحميل 5 ميكرولتر من مزيج الواسمات الجزيئية على جانبي عينات الحمض النووي المهضومة الجينومية إذا كان هناك عدد أكبر من العينات (~ 10) ، أو على جانب واحد فقط إذا كان هناك أقل من أو يساوي خمس عينات.</li>
	<li>قم بتشغيل الجل عند 5 فولت / سم لمدة 6 ساعات. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بعمل شق على أحد أركان الجل لتحديد ترتيب التحميل.</li>
	<li>اغمر الجل في 0.25 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف.</li>
	<li>شطف الجل مرتين بالماء المقطر.</li>
	<li>قم بتشويه الحمض النووي عن طريق غمر الجل في محلول 0.5 M NaOH و 1.5 M NaCl مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف.</li>
	<li>شطف الجل مرتين بالماء المقطر.</li>
	<li>قم بتحييد الحمض النووي عن طريق غمر الجل في محلول 0.5 M tris-HCl و 3 M NaCl (درجة الحموضة 7.5) مرتين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف.</li>
</ol>5. النشاف الجنوبي
<ol><li>قطع غشاء النايلون من 10 سم × 12 سم في الحجم وجعل الشق في نفس موقف الجل.</li>
	<li>قم بتنشيط الغشاء عن طريق الغمس في الماء المقطر متبوعا بمحلول سترات محلول ملحي الصوديوم (SSC) 20x (انظر الجدول 1).</li>
	<li>قم بإعداد النقل.<ol><li>خذ صينية زجاجية نظيفة وضع صينية أخرى فيها في وضع مقلوب. قم بإنشاء فتيل باستخدام ورق ترشيح عادي بحيث تلامس الأطراف قاعدة الدرج الخارجي.</li>
		<li>ضع الجل فوق ورق الترشيح. ضع غشاء النايلون المنشط برفق فوق الجل ، مع تداخل الشقوق ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق التدحرج فوق قضيب زجاجي.</li>
		<li>ضع كومة 2 سم من ورق ترشيح السليلوز 9.5 سم × 11.5 سم ، متبوعا بكومة 6 سم من ورق الترشيح العادي بنفس الأبعاد. ضع وزنا فوق هذا الإعداد بحيث يكون هناك توزيع متساو للوزن أدناه. املأ الدرج الخارجي بمخزن مؤقت SSC 20x (انظر الشكل 2).</li>
		<li>اترك الإعداد للنقل بين عشية وضحاها.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد النقل الجنوبي ، قم بتثبيت الحمض النووي المنقول على الغشاء عن طريق التشابك فوق البنفسجي على جهاز تحويل الأشعة فوق البنفسجية أو رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية. استخدم مصباح 302 نانومتر 8 واط لمدة 5 دقائق ، أو مصباح 254 نانومتر 8 واط لمدة 2 دقيقة ، وهو ما يعادل حوالي 120 مللي جول. تأكد من أن جانب الغشاء الذي يتم نقل الحمض النووي عليه يواجه المصباح.</li>
	<li>اغسل الغشاء مرتين باستخدام 25 مل من 2x SSC buffer.</li>
	<li>أوقف البروتوكول مؤقتا ، إذا لزم الأمر ، عن طريق تجفيف البقعة تماما وتخزينها عند 2-8 درجة مئوية بعد لفها بشكل غير محكم في ورق القصدير ، حتى تتم المعالجة الإضافية.</li>
</ol>6. التهجين والكشف عن التلألؤ الكيميائي
<ol><li>سخن المخزن المؤقت للتهجين المسبق إلى 42 درجة مئوية. ملاحظة: تتضمن الخطوات التالية كميات المحاليل / المخازن المؤقتة التي سيتم استخدامها لكل 100 سم2 من اللطخة.</li>
	<li>احتضان الغشاء في 10 مل من المخزن المؤقت قبل التهجين لمدة 1 ساعة عند 42 درجة مئوية مع التقليب اللطيف للتهجين المسبق.</li>
	<li>أضف 0.5 ميكرولتر من مسبار التيلومير لكل 5 مل من المخزن المؤقت للتهجين المسبق التسخين لصنع محلول التهجين.</li>
	<li>احتضان اللطخة في 10 مل من محلول التهجين عند 42 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع التقليب اللطيف.</li>
	<li>اغسل اللطخة بمحلول مؤقت صارم 1 (الجدول 1) مرتين لمدة 10 دقائق (25 مل لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة مع تحريط لطيف.</li>
	<li>المخزن المؤقت الصارم 2 (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.</li>
	<li>اغسل اللطخة بمحلول مؤقت صارم 2 مرتين لمدة 15 دقيقة (25 مل لكل منهما) عند 50 درجة مئوية مع تحريط لطيف.</li>
	<li>اشطفيه ب 15 مل من محلول الغسيل لمدة 5 دقائق مع التقليب اللطيف في RT.</li>
	<li>احتضان الغشاء في 10 مل من محلول حجب 1x المحضر حديثا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف.</li>
	<li>احتضان الغشاء في 10 مل من مضاد الديجيوكسيجينين المترافق مع محلول عمل الفوسفاتيز القلوي (انظر الجدول 2) لمدة 30 دقيقة في RT مع تحريض لطيف.</li>
	<li>اغسل اللطخة مرتين باستخدام المخزن المؤقت للغسيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع تحريط لطيف.</li>
	<li>احتضان في 10 مل من المخزن المؤقت للكشف لمدة 5 دقائق في RT مع تحريض لطيف.</li>
	<li>قم بإزالة المخزن المؤقت للكشف الزائد واحتفظ بالغشاء مع توجيه الحمض النووي لأعلى على كيس تهجين أو صفيحة خلات. أضف ~ 1-1.5 مل من محلول الركيزة بالتنقيط على الغشاء ، ضع ورقة أخرى على الفور ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT.</li>
	<li>الضغط على حل الركيزة الزائدة للتصوير.</li>
	<li>قم بتصوير اللطخة لمدة 20 دقيقة تقريبا في نظام تصوير وثائق هلامية ، مع جمع صور متعددة في نقاط زمنية مختلفة. حدد الصور غير المشبعة لمزيد من التحليل. ملاحظة: في حالة ضعف الإشارة ، يمكن إجراء التصوير لفترة أطول من الوقت.</li>
</ol>7. التحليل
<ol><li>بعد الحصول على ملفات الصور ، قم بتصديرها للنشر بتنسيق .tif بأعلى دقة ممكنة (600 نقطة في البوصة في هذه الحالة).</li>
	<li>قم بتثبيت برنامج Telotool . يتطلب هذا إصدارا محددا (R2012a) من MATLAB (متاح مجانا) للتشغيل.</li>
	<li>افتح البرنامج وانقر على زر تحميل ملف الصورة في أعلى اليمين.</li>
	<li>بعد تحميل الصورة ، انقر فوق عكس الصورة ، بحيث تكون خلفية الصورة سوداء وتكون اللطاخات / الأشرطة بيضاء.</li>
	<li>اقتصاص الصورة مع الزوايا العليا بدءا من الآبار. بعد إجراء تحديد الاقتصاص ، انقر بزر الماوس الأيمن بداخله وحدد اقتصاص الصورة.</li>
	<li>بعد اقتصاص الصورة ، انقر فوق حساب الممرات واسمح باكتشاف المسار تلقائيا.</li>
	<li>إذا لم يتم اكتشاف الممرات بشكل صحيح ، على سبيل المثال ، إذا لم يتم اكتشاف ممرات معينة على الإطلاق ، أو إذا تم اكتشاف ممرات إضافية أو جزئية ، فقم بإجراء تعديل المسار كما هو موضح أدناه.<ol><li>انقر فوق ضبط الممرات وفي النافذة المنبثقة التي تفتح ، أضف و / أو اضبط الممرات حسب الحاجة ، وانقر فوق تطبيق وإغلاق.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد ضبط الممرات ، تأكد من رؤية نقطة حمراء على كل من الممرات واضبط السلالم باستخدام زر Ladder Fit ، مع التأكد من أن عدد القمم في كلا حارتي السلم في نفس الموضع. قم بإزالة أي قمم غريبة باستخدام زر حذف الحد الأقصى .</li>
	<li>بعد ضبط السلالم ، حدد ملفات تعريف المسار ، وانقر فوق ملاءمة السلم ، وحدد ملاءمة متعددة الحدود.</li>
	<li>انقر فوق Trendline ، على النحو الموصى به من قبل البرنامج ، ثم حدد مصحح في الخيار التالي.</li>
	<li>انقر فوق الحصول على النتائج لعرض النتائج كجدول ، حيث يكون متوسط صف TRF هو قياس طول التيلومير لعينات الحارة المعنية.</li>
	<li>انقر فوق حفظ الكل لتخزين النتائج في شكل جدول بيانات.</li>
</ol>

قياس طول التيلومير باستخدام الكشف عن التلألؤ الكيميائي غير المشع

<ol>
	<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulation.">Telomere length regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).</li><li>Valdes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+cigarette+smoking,+and+telomere+length+in+women.">Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women.</a> Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).</li><li>Allsopp, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+predicts+replicative+capacity+of+human+fibroblasts.">Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).</li><li>Epel, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+telomere+shortening+in+response+to+life+stress.">Accelerated telomere shortening in response to life stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).</li><li>Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+telomere+length+quantification+by+FISH+and+its+application+to+human+population+studies.">High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).</li><li>R&#233;v&#233;sz, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+as+a+marker+of+cellular+aging+is+associated+with+prevalence+and+progression+of+metabolic+syndrome.">Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).</li><li>Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+variations+in+aging+and+age-related+diseases.">Telomere length variations in aging and age-related diseases.</a> Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+restriction+fragment+(TRF)+analysis.">Telomere restriction fragment (TRF) analysis.</a> Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).</li><li>Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+its+role+in+the+aging+pathways:+telomere+shortening,+cell+senescence+and+mitochondria+dysfunction.">Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction.</a> Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).</li><li>G&#246;hring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeloTool:+a+new+tool+for+telomere+length+measurement+from+terminal+restriction+fragment+analysis+with+improved+probe+intensity+correction.">TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).</li><li>Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+terminal+restriction+fragment+analysis+for+quantifying+telomere+length+using+in-gel+hybridization.">Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).</li><li>Fojtov&#225;, M., Fajkus, P., Sov&#225;kov&#225;, P. P., Fajkus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+restriction+fragments+(TRF)+method+to+analyze+telomere+lengths.">Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths.</a> Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Trigodet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+molecular+weight+DNA+extraction+strategies+for+long-read+sequencing+of+complex+metagenomes.">High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes.</a> Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).</li><li>Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+telomere+length+measurement+methods.">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).</li><li>Mochida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+size+and+telomerase+activity+in+Epstein-Barr+virus+(EBV)-positive+and+EBV-negative+Burkitt's+lymphoma+cell+lines.">Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines.</a> Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+senescence,+telomere+shortening+and+cell+proliferation+rate+in+Gaddi+goat's+skin+fibroblast+cell+line.">Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line.</a> Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).</li><li>Michaeli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+telomere+length+correlates+with+extended+female+fertility.">Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility.</a> Cells. 11 (3), 513 (2022).</li><li>Lesmana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+reference+intervals+for+leukocyte+telomere+length+in+children:+the+method+matters.">Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

وصفنا إجراء مفصلا لطريقة غير مشعة قائمة على التلألؤ الكيميائي لقياس طول التيلومير باستخدام النشاف الجنوبي. وقد اختبر البروتوكول للسماح بالاستخدام الحكيم للعديد من الكواشف دون المساس بجودة النتائج. يمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت للتهجين والتهجين حتى خمس مرات. يمكن أن يتراوح تركيز الإن...

التيلوميرات هي تسلسلات الحمض النووي المتكررة الموجودة في نهاية الكروموسومات. لديهم تكرارات ترادفية ل TTAGGG ويحافظون على سلامة الجينوم من خلال حماية الكروموسوم من كل من الاهتراء ومشكلة النسخ المتماثل النهائي ، مما يعني أن جزءا من الجزء المتدلي 3 بوصات لا يمكن تكراره بواسطة بوليميراز الحمض النووي 1,2. تؤدي التيلوميرات القصيرة إلى تشوهات كروموسومية في الخلايا ، بسبب توقف الخلايا بشكل دائم في مرحلة تسمى الشيخوخة المتماثلة3. تسبب التيلوميرات القصيرة أيضا مجموعة من المشاكل الأخرى ، مثل خلل الميتوكوندريا 4,5 وخلل الخلية.
يتم فقدان التكرارات التيلوميرية للحمض النووي عندما تنقسم الخلية ، بمتوسط خسارة من 25 إلى 200 نقطة أساس في السنة 6 ، مما يؤدي إلى الشيخوخة الخلوية بعد عدد معين من الانقسامات6. ترتبط الشيخوخة بتواتر أعلى من الأمراض المصاحبة ، والتي تتميز بتقصير طولالتيلومير 7. تحليل جزء تقييد التيلومير (TRF) ، كما وصفه ميندر ، هو طريقة مكلفة للغاية8. لهذا السبب ، لا يتم تنفيذه أثناء تحديد طول التيلومير في معظم الدراسات.
في الوقت الحاضر ، تستخدم غالبية الدراسات الوبائية قياسات كمية لطول التيلومير القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على qPCR هي طريقة قياس نسبية ، لأنها تقيس النسبة بين التيلوميرات ومنتجات تضخيم الجينات أحادية النسخة ، وليس طول التيلومير المطلق. قياس طول التيلومير باستخدام بروتوكول TRF هو الطريقة القياسية الذهبية ، حيث يمكنه قياس توزيع طول التيلومير في العينة ويمكن التعبير عن القياسات بالقيم المطلقة بالكيلوباس (kb). ومع ذلك ، فإن استخدامه محدود لأنه مرهق وكثيف العمالة ومكلف. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لقياس طول التيلومير باستخدام TRFs القائمة على التلألؤ الكيميائي.
يتضمن تحليل TRF سبع خطوات رئيسية: 1) زراعة الخلايا لاستخراج الحمض النووي الجينومي ، 2) استخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام الفينول: الكلوروفورم: طريقة كحول الأيزو أميل(P: C: I) ، 3) تقييد هضم الحمض النووي الجينومي ، 4) هلام الأغاروز الكهربائي ، 5) النشاف الجنوبي لجزء الحمض النووي لهضم التقييد ، 6) التهجين والكشف عن طريق التلألؤ الكيميائي - يتم تصور مسبار التيلومير المتجمد بواسطة ركيزة كيميائية شديدة الحساسية للفوسفاتيز القلوي ، ثنائي الصوديوم 2-كلورو -5- (4-ميثوكسي سبيرو [1،2-ديوكسيتان-3،2′- (5-كلوروتريسيكلو [3.3.1.13.7] ديكان]) -4-يل] -1-فينيل فوسفات (CDP-Star) - و 7) تحليل للحصول على متوسط طول التيلومير ومعلومات النطاق من هذه اللطاخات التيلومية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)</td>
			<td>Received as a gift</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Universal hood II (721BR14277)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop (Epoch 2)</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeloTool</td>
			<td>Version 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP</td>
			<td>180720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>HyClone, Cytiva, USA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>76-47-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11209299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE healthcare lifesciences</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti DIG AP</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection buffer 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig easy hyb</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinf 1</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinf 1 (alternative to kit)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0155T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>BIOLABS</td>
			<td>N3231S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid buffer 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular marker</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rsa 1</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rsa 1 (alternative to kit)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of performance parameters of the taggg telomere length assay

التيلوميرات هي تسلسلات متكررة موجودة في نهايات الكروموسومات. تقصيرها هو سمة مميزة للخلايا الجسدية البشرية. يحدث التقصير بسبب مشكلة في النسخ المتماثل النهائي وغياب إنزيم التيلوميراز المسؤول عن الحفاظ على طول التيلومير. ومن المثير للاهتمام أن التيلوميرات تقصر أيضا استجابة للعمليات الفسيولوجية الداخلية المختلفة ، مثل الإجهاد التأكسدي والالتهاب ، والتي قد تتأثر بسبب العوامل خارج الخلية مثل الملوثات أو العوامل المعدية أو المغذيات أو الإشعاع. وبالتالي ، فإن طول التيلومير بمثابة علامة حيوية ممتازة للشيخوخة ومعايير الصحة الفسيولوجية المختلفة. تستخدم مجموعة فحص طول التيلومير TAGGG لتحديد متوسط أطوال التيلومير باستخدام مقايسة جزء تقييد التيلومير (TRF) وهي قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. ومع ذلك ، فهي طريقة مكلفة ، ولهذا السبب ، لا يتم استخدامها بشكل روتيني لأعداد العينات الكبيرة. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس محسن وفعال من حيث التكلفة لطول التيلومير باستخدام البقع الجنوبية أو تحليل TRF والكشف القائم على التلألؤ الكيميائي غير المشع.

Telomeres are the repetitive DNA sequences present at the end of chromosomes. They have tandem repeats of TTAGGG and maintain genome integrity by protecting the chromosome from both fraying and the end replication problem, which means that part of the 3&#39; overhang is unable to be replicated by DNA polymerase1,2. Short telomeres lead to chromosomal abnormalities in cells, due to which cells become permanently arrested in a stage called replicative senescence3. Short telomeres also cause a host of other problems, such as mitochondria dysfunction4,5 and cell dysfunction.
DNA telomeric repeats are lost as and when the cell divides, with an average loss of 25 to 200 bp per year6, resulting in cellular senescence after a certain number of divisions6. Aging is associated with a higher frequency of comorbidities, which is marked by a shortening in telomere length7. Telomere restriction fragment (TRF) analysis, as described by Mender, is a very expensive method8. Because of this, it is not implemented while quantifying telomere length in most studies.
Presently, the majority of epidemiological studies employ quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based measurements of telomere length. However, the qPCR-based method is a relative measurement method, as it measures the ratio between telomeres and single-copy gene amplification products, and not absolute telomere length. Telomere length measurement using the TRF protocol is the gold standard method, as it can measure telomere length distribution in the sample and measurements can be expressed in absolute values in kilobases (kb). However, its use is limited because it is cumbersome, labor-intensive, and costly. Here, we present an optimized protocol for telomere length measurement using chemiluminescence-based TRFs.
TRF analysis includes seven major steps: 1) culturing of cells for genomic DNA extraction, 2) genomic DNA extraction using the phenol:chloroform:isoamylalcohol (P:C:I) method, 3) restriction digestion of genomic DNA, 4) agarose gel electrophoresis, 5) Southern blotting of the restriction digestion DNA fragment, 6) hybridization and detection via chemiluminescence-the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenyl phosphate (CDP-Star)-and 7) analysis for obtaining mean telomere length and range information from these telomeric smears.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG  

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

The scope of our research involves measuring telomere length differences across various study groups. The questions we are trying to answer revolve around diseases of physiological conditions and how they may affect telomere length and vice versa. The technology is currently used to advance research in the field of telomere length biology are nanopore sequencing and more recently CRISPR Cas based measurement.Current experimental challenges are accurately measuring absolute telomere length and the changes in it. The same sample could give varying results when different methods of measuring telomere length are used. The research gap we address is the lack of a standard method to measure telomere length.Telomere restriction fragment analysis or TRF, is still the standard against which all new techniques are evaluated. Also, our optimized protocols helps in processing a higher number of samples with limited resources. Our findings will help advance research in the field of telomere length biologic by providing a reliable and relatively economical way to compare newer methods to the gold standard, which is TRF.Our laboratory will focus on the effects of small molecule inhibitors on telomere length. We will also study the impact that lifestyle diseases and telomere length have on on each other.

أظهر الحمض النووي الجينومي المستخرج (gDNA) ، والذي تم تشغيله على هلام أغاروز 1٪ ، سلامة جيدة ، كما هو موضح في الشكل 1B ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام العينة لمزيد من المعالجة النهائية ل TRFs. ثم تم إجراء اختبار TRF عن طريق تعديل أحجام الحلول المطلوبة في كل خطوة (انظر الجدول 1</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay at JoVE.com

هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكول تحديد طول التيلومير باستخدام الكشف الكيميائي غير المشع ، مع التركيز على تحسين معلمات الأداء المختلفة لمجموعة فحص طول التيلومير TAGGG ، مثل الكميات العازلة وتركيزات المسبار.

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

يتضمن نطاق بحثنا قياس الاختلافات في طول التيلومير عبر مجموعات الدراسة المختلفة. تدور الأسئلة التي نحاول الإجابة عليها حول أمراض الحالات الفسيولوجية وكيف يمكن أن تؤثر على طول التيلومير والعكس صحيح. تستخدم هذه التقنية حاليا لتطوير البحث في مجال بيولوجيا طول التيلومير وتسلسل المسام النانوية ومؤخرا القياس القائم على كريسبر كاس.التحديات التجريبية الحالية هي قياس دقيق لطول التيلومير المطلق والتغيرات فيه. يمكن أن تعطي نفس العينة نتائج متفاوتة عند استخدام طرق مختلفة لقياس طول التيلومير. الفجوة البحثية التي نعالجها هي عدم وجود طريقة قياسية لقياس طول التيلومير.لا يزال تحليل شظايا تقييد التيلومير أو TRF هو المعيار الذي يتم من خلاله تقييم جميع التقنيات الجديدة. أيضا ، تساعد بروتوكولاتنا المحسنة في معالجة عدد أكبر من العينات بموارد محدودة. ستساعد النتائج التي توصلنا إليها في تطوير البحث في مجال طول التيلومير البيولوجي من خلال توفير طريقة موثوقة واقتصادية نسبيا لمقارنة الطرق الأحدث بالمعيار الذهبي ، وهو TRF.سيركز مختبرنا على تأثيرات مثبطات الجزيئات الصغيرة على طول التيلومير. سندرس أيضا تأثير أمراض نمط الحياة وطول التيلومير على بعضها البعض.

optimization-performance-parameters-taggg-telomere-length

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

1.5K Views.  SVKM's NMIMS Deemed-to-be-University. يتضمن نطاق بحثنا قياس الاختلافات في طول التيلومير عبر مجموعات الدراسة المختلفة. تدور الأسئلة التي نحاول الإجابة عليها حول أمراض الحالات الفسيولوجية وكيف يمكن أن تؤثر على طول التيلومير والعكس صحيح. تستخدم هذه التقنية حاليا لتطوير البحث في مجال بيولوجيا طول التيلومير وتسل?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG  

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis

Begin by adding 500 microliters of the lysis buffer to the previously obtained A2780 cell pellet, and mix gently using a cut tip with a minimum opening diameter of two millimeters. Add 20 micrograms per milliliter of freshly prepared RNase and mix by gentle inversion. Incubate it at 37 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of incubation, add proteinase K to a final concentration of 100 micrograms per milliliter and gently invert 10 times. Incubate again at 55 degrees Celsius for one hour inverting the tube every 10 minutes. Pipette 500 microliters of phenol:chloroform:isoamyl alcohol reagent into the tube and gently invert the tube about 20 times.Centrifuge it at 9, 391 G for 15 minutes at room temperature. Pipette the upper aqueous viscous layer into a new tube. Add an equal volume of chloroform and mix by gentle inversion.After centrifuging the tube once, collect the aqueous layer. Add an appropriate amount of five molar sodium chloride in the tube to increase the concentration by 0.2 moles. Add two volumes of 100%ethanol into the tube and invert it gently 20 times.Centrifuge at 15, 871 G for five minutes at room temperature. After discarding the supernatant, add 500 microliters of 70%ethanol. Centrifuge again at the same condition and then discard the supernatant.Once the pellet is air dried, add 50 microliters of sterile nuclease free water and let it rehydrate. Then mix the DNA by pipetting using the cut tip. Use UV spectrophotometry to measure the concentration of DNA.After digesting the DNA, separate it using 0.8%agarose. Submerge the agarose gel in 0.25 molar hydrochloric acid solution for 10 minutes at room temperature with gentle agitation. Then rinse the gel twice with distilled water.To denature the DNA, submerge the gel in a solution of sodium hydroxide and sodium chloride. Then rinse the gel twice with distilled water. To neutralize the DNA as demonstrated, submerge the gel in a solution of 0.5 molar hydrochloric acid and three molar sodium chloride at pH seven.The extractor genomic DNA showed good integrity indicating its use for further downstream processing of telomere restriction fragments.

A2780 عزل وتحليل الحمض النووي الجينومي للخلايا

Southern Blotting, Hybridization, and Chemiluminescence Detection of Genomic DNA Isolated from A2780 Cells

To perform southern blotting, start by cutting a nylon membrane into a 10 by 12 centimeter sized segment. Make a notch in the same position as the gel. Activate the membrane by dipping it in distilled water, followed by 20X sodium saline citrate buffer.Place a filter paper wick on a double inverted tray, set such that the ends touch the base of the outer tray. Place the gel over the filter paper. Then place the activated nylon membrane over the gel, ensuring that the notches overlap.Remove any air bubbles with a glass rod. Place a two centimeter heap of 9.5 by 11.5 centimeter sized cellulose filter paper, and another six centimeter heap of regular filter paper. Place a weight atop the setup for equal weight distribution.Fill the outer tray with 20X sodium saline citrate buffer, and leave it overnight for efficient transfer. After southern transfer, fix the transferred DNA on the membrane by UV crosslinking on a UV transilluminator. Wash the membrane twice with 25 milliliters of 2X sodium saline citrate buffer.To perform hybridization, incubate the membrane in 10 milliliters of the pre-warmed pre-hybridization buffer. Gently agitate the membrane manually at frequent intervals. Then incubate the blot in 10 milliliters of hybridization buffer at 42 degrees Celsius for three hours with gentle agitation.Wash the blot twice in 25 milliliters of stringent buffer for 10 minutes at room temperature with gentle agitation. Now wash the blot twice in 25 milliliters of pre-warmed stringent buffer at 50 degrees Celsius for 15 minutes with gentle agitation. Rinse with 15 milliliters of wash buffer for five minutes with gentle agitation at room temperature.Incubate the membrane in 10 milliliters of freshly prepared blocking solution for 30 minutes at room temperature with gentle agitation. Then place it in 10 milliliters of anti-digoxigenin conjugated with an alkaline phosphatase working solution. Wash the blot twice in the wash buffer at room temperature for 15 minutes.Now incubate in 10 milliliters of detection buffer for five minutes at room temperature. After removing the excess buffer, place the membrane on an acetate sheet with the DNA side facing up. Add approximately one to 1.5 milliliters of substrate solution dropwise on the membrane.Immediately place another acetate sheet on it and incubate for five minutes at room temperature. Squeeze out the excess substrate solution before imaging. Using a gel documentation imaging system, collect multiple unsaturated images at different time points for analysis.After southern blotting and hybridization, the telomere restriction fragments were clearly visible, indicated by a smear.