نشكر أعضاء مختبر إيفانز على ملاحظاتهم المدروسة حول هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل علماء ديوك وايتهيد ، وعلماء ديوك للعلوم والتكنولوجيا ، وزمالة هانا جراي في معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). تم عمل الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.

القياس الكمي لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة يعلنونها.

يمكن استخدام سير العمل الموضح هنا لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بقوة وقابلية التكرار باستخدام التصوير القائم على التألق30. هناك قيود فنية مهمة يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجارب. تم نقل خلايا هيلا باستخدام ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT2...

شبكة الميتوكوندريا عبارة عن سلسلة من العضيات المترابطة التي تلعب دورا حاسما في إنتاج الطاقة1 ، والمناعة الفطرية2,3 ، وإشارات الخلية 4,5. ارتبط عدم تنظيم الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)6,7. PD هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يؤثر على الخلايا العصبية الدوبامينية للمادة السوداء التي تؤثر على ما يقرب من 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم8. تم ربط PD وراثيا ب mitophagy ، وهو مسار لمراقبة جودة الميتوكوندريا ضروري للحفاظ على التوازن الخلوي الذي يزيل بشكل انتقائي الميتوكوندرياالتالفة 9,10. حددت الدراسات العديد من مسارات الميتوفاجي المستقلة ، بما في ذلك مجال FUN14 الذي يحتوي على ميتوفاجي بوساطة 1 (FUNDC1) ، وبروتين Bcl-2 المتفاعل 3 (BNIP3) الميسر ، والميتوفاجي المعتمد على NIX ، والكيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) / الميتوفاجي المنظم بمرض باركين10،11. يعمل PINK1 (كيناز مفترض) وباركين (E3 ubiquitin ligase) جنبا إلى جنب مع الميتوكوندريا التالفة من فوسفو-يوبيكوتينات ، والتي تدفع إلى تكوين البلعمة الذاتية التي تبتلع العضية التالفة وتندمج مع الليزوزومات لبدء التدهور12،13،14،15،16. ارتبطت الطفرات في باركين بالأنماط الظاهرية المرتبطة بمرض باركين مثل التنكس العصبي عن طريق فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية17,18.
هنا ، يتم وصف بروتوكول تستخدم فيه خلايا HeLa ، وهي خلايا خلدة تستخدم بشكل روتيني مشتقة من سرطان عنق الرحم ، للتحقيق في دور Parkin في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا. تعبر خلايا هيلا عن مستويات ضئيلة من باركين داخلي المنشأ وبالتالي تتطلب تعبير باركين خارجيالمنشأ 19. لدراسة دور باركين في صحة شبكة الميتوكوندريا ، يتم نقل خلايا هيلا إما باستخدام باركين من النوع البري (ParkinWT) ، أو متحور باركين (ParkinT240R) ، أو ناقل تحكم فارغ. ParkinT240R هو طفرة وراثية جسدية متنحية في مرض باركنسون الأحداث تؤثر على نشاط Parkin E3 ligase ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة مسار الميتوفاجي20. تخضع خلايا هيلا لتركيزات خفيفة (5 ميكرومتر) أو شديدة (20 ميكرومتر) من سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) ، وهو عامل فصل الميتوكوندريا. يستخدم العلاج بتركيزات شديدة من CCCP بشكل روتيني للحث على الميتوفاجي بوساطة باركين في خطوط الخلايا المختلفة ، مثل خلايا HeLa و COS-721،22،23.
بعد العلاج ، يستخدم البروتوكول التصوير الحي لشبكة الميتوكوندريا باستخدام اثنين من الأصباغ الفلورية المستهدفة للميتوكوندريا المتاحة حاليا. رباعي ميثيل رودامين ، إستر الإيثيل ، بيركلورات (TMRE) عبارة عن صبغة كاتيونية تتألق بناء على إمكانات غشاء الميتوكوندريا24 ، في حين أن MitoSOX هو مؤشر فائق أكسيد الميتوكوندريا حيث تكون شدة التألق دالة لتركيز الأكسيد الفائق25. أخيرا ، يستخدم البروتوكول المبين تقديرا كميا قائما على التألق وسير عمل بسيط لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال مع الحد الأدنى من نطاق تحيز المستخدم. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تصميمه لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في خلايا هيلا ، إلا أنه يمكن تكييفه مع خطوط الخلايا الإضافية وأنواع الخلايا الأولية لتوصيف صحة شبكة الميتوكوندريا كميا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Anhydrous</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#160; Red&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa-M (Homo sapiens)</td>
			<td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EYFP Empty Vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin T240R</td>
			<td>This Paper</td>
			<td>Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFP-Parkin WT</td>
			<td>Addgene; PMID:19029340</td>
			<td>RRID:Addgene_23955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td>
			<td>(Schindelin, 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Spreadsheet Software)</td>
			<td>Microsoft Office&#160;</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>https://www.microsoft.com/excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism9 (Statistical Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>https://www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Incubator (Environmental Chamber)</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMiL Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHTNING Deconvolution Software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STELLARIS 8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based quantification of mitochondrial membrane potential and superoxide levels using live imaging in hela cells

الميتوكوندريا عضيات ديناميكية ضرورية للاتزان الداخلي الأيضي من خلال التحكم في إنتاج الطاقة عن طريق تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). لدعم التمثيل الغذائي الخلوي ، تتعاون آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا المختلفة للحفاظ على شبكة ميتوكوندريا صحية. أحد هذه المسارات هو الميتوفاجي ، حيث يسهل كيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) و Parkin phospho-ubiquitination للميتوكوندريا التالفة عزل البلعمة الذاتية والإزالة اللاحقة من الخلية عن طريق اندماج الليزوزوم. الميتوفاجي مهم للاتزان الخلوي ، وترتبط الطفرات في باركين بمرض باركنسون (PD). بسبب هذه النتائج ، كان هناك تركيز كبير على التحقيق في تلف الميتوكوندريا ودورانها لفهم الآليات الجزيئية وديناميكيات مراقبة جودة الميتوكوندريا. هنا ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لتصور شبكة الميتوكوندريا لخلايا HeLa ، لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بعد العلاج باستخدام سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ، وهو عامل فك ارتباط الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن طفرة مرتبطة بمرض باركين (ParkinT240R) والتي تثبط الميتوفاجي المعتمد على باركين لتحديد كيفية تأثير التعبير الطافر على شبكة الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التي تعبر عن باركين من النوع البري. يصف البروتوكول الموضح هنا سير عمل بسيط باستخدام مناهج قائمة على التألق لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال.

The mitochondrial network is a series of interconnected organelles that play a crucial role in energy production1, innate immunity2,3, and cell signalling4,5. Mitochondrial dysregulation has been associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson&#39;s disease (PD)6,7. PD is a progressive neurodegenerative disorder affecting dopaminergic neurons of the substantia nigra that impacts nearly 10 million people worldwide8. PD has been genetically linked to mitophagy, a mitochondrial quality control pathway necessary for maintaining cellular homeostasis that selectively removes damaged mitochondria9,10. Studies have identified multiple independent mitophagy pathways, including FUN14 domain containing 1 (FUNDC1)-mediated mitophagy, Bcl-2 interacting protein 3 (BNIP3)-facilitated mitophagy, NIX-dependent mitophagy, and the well-characterized PTEN-induced kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulated mitophagy10,11. PINK1 (a putative kinase) and Parkin (an E3 ubiquitin ligase) work in tandem to phospho-ubiquitinate damaged mitochondria, which drives the formation of autophagosomes that engulf the damaged organelle and fuse with lysosomes to initiate degradation12,13,14,15,16. Mutations in Parkin have been associated with PD-linked phenotypes such as neurodegeneration via the loss of dopaminergic neurons17,18.
Here, a protocol is described in which HeLa cells, routinely used immortalized cells derived from cervical cancer, are used to investigate the role of Parkin in maintaining mitochondrial network health. HeLa cells express negligible levels of endogenous Parkin and therefore require exogenous Parkin expression19. To study the role of Parkin in mitochondrial network health, HeLa cells are transfected with either wild-type Parkin (ParkinWT), a Parkin mutant (ParkinT240R), or an empty control vector. ParkinT240R is an autosomal recessive juvenile parkinsonism mutation that affects Parkin E3 ligase activity, significantly reducing the efficiency of the mitophagy pathway20. HeLa cells are subject to mild (5 &#181;M) or severe (20 &#181;M) concentrations of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. Treatment with severe concentrations of CCCP is routinely used to induce Parkin-mediated mitophagy in various cell lines, such as HeLa and COS-7 cells21,22,23.
Following treatment, the protocol employs live imaging of the mitochondrial network using two currently available mitochondrial-targeted fluorescent dyes. Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) is a cationic dye that fluoresces based on mitochondrial membrane potential24, while MitoSOX is a mitochondrial superoxide indicator where the fluorescence intensity is a function of superoxide concentration25. Finally, the outlined protocol uses a fluorescence-based quantification and simple workflow to effectively quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels with minimal scope for user bias. Although this protocol was designed to study mitochondrial function in HeLa cells, it can be adapted for additional cell lines and primary cell types to quantitively characterize mitochondrial network health.

تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا  

القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا

This research focuses on mitochondria dysregulation in neurodegenerative diseases. We believe that this research can be used to understand potential causes for disease onset that could lead to therapeutics combating neurodegenerative diseases like Parkinson's disease and ALS. Techniques such as super resolution microscopy like STED and SIM or expansion microscopy have improved the ability to accurately understand protein distribution within individual organelles and mitochondria distribution throughout the cell.Results of this technique can be used as a starting point to study the effect of Parkinson's disease linked mutations on mitochondrial turnover and begin to understand the importance of regulating reactive oxygen species levels and mitochondrial membrane potential to maintain neuronal health. Our laboratory aims to mechanistically characterize individual mitochondrial quality control pathways to understand the interplay between these pathways. By having insights into pathway dynamics, one can understand how mitochondria are maintained and how mitochondrial dysregulation contributes to neurodegenerative disease onset.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام القياس الكمي القائم على التألق لقياس إمكانات الغشاء ومستويات الأكسيد الفائق لشبكة الميتوكوندريا بعد معالجة CCCP (الشكل 1). استخدم سير العمل هذا خلايا هيلا ، وهي خط خلوي خالد مشتق من سرطان عنق الرحم. تستخدم خلايا هيلا بشكل روتيني لدراسة بيولوجيا ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells at JoVE.com

تصف هذه التقنية سير عمل فعال لتصور وقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق داخل خلايا هيلا باستخدام التصوير الحي القائم على التألق.

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

يركز هذا البحث على عدم تنظيم الميتوكوندريا في الأمراض التنكسية العصبية. نعتقد أنه يمكن استخدام هذا البحث لفهم الأسباب المحتملة لظهور المرض والتي يمكن أن تؤدي إلى علاجات تكافح الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري. حسنت تقنيات مثل الفحص المجهري فائق الدقة مثل STED و SIM أو الفحص المجهري التوسعي القدرة على فهم توزيع البروتين بدقة داخل العضيات الفردية وتوزيع الميتوكوندريا في جميع أنحاء الخلية.يمكن استخدام نتائج هذه التقنية كنقطة انطلاق لدراسة تأثير الطفرات المرتبطة بمرض باركنسون على دوران الميتوكوندريا والبدء في فهم أهمية تنظيم مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية وإمكانات غشاء الميتوكوندريا للحفاظ على صحة الخلايا العصبية. يهدف مختبرنا إلى توصيف مسارات مراقبة جودة الميتوكوندريا الفردية ميكانيكيا لفهم التفاعل بين هذه المسارات. من خلال الحصول على نظرة ثاقبة لديناميكيات المسار ، يمكن للمرء أن يفهم كيف يتم الحفاظ على الميتوكوندريا وكيف يساهم خلل تنظيم الميتوكوندريا في ظهور الأمراض التنكسية العصبية.

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

3.1K Views.  Duke University Medical Center. يركز هذا البحث على عدم تنظيم الميتوكوندريا في الأمراض التنكسية العصبية. نعتقد أنه يمكن استخدام هذا البحث لفهم الأسباب المحتملة لظهور المرض والتي يمكن أن تؤدي إلى علاجات تكافح الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري. حسنت تقنيات مثل الفحص المجهر?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا  

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Begin by mixing 200 microliters of reduced serum media with two micrograms of any one plasmid DNA separately in a sterile micro centrifuge tube one. Repeat this for two other plasmids in separate tubes. Then in the new tube two, mix 200 microliters of reduced serum media with six microliters of transfection reagent and mix the contents by pipetting.Incubate the tubes for five minutes at room temperature before mixing the content of tube two to tube one. In separate tubes, repeat the mixing of the other two plasmids with a transfection reagent. Incubate the mixture for 20 minutes at room temperature.Next, drop-wise, add the transfection complexes to the HeLa cell culture-seeded imaging dishes, ensuring equal distribution across the entire dish. One hour before imaging, open the carbon dioxide tank valve and turn on the environmental controller for the microscope. Using the up and down arrows on the touch pad, adjust the temperature to 37 degrees Celsius and the carbon dioxide to 5%Press Set when complete.To adjust the laser settings, turn on the white light laser by clicking the Acquire tab and selecting Open Laser Overview. In the dialogue box, toggle the white light laser to on. Enter laser power as 85%Click the excitation control button and select maximum power from the dropdown menu.Begin the tetraethyl rhodamine ethyl ester percolate or TMRE, experiment by setting the excitation laser to 514 nanometers and the emission spectra window to 524 to 545 nanometers for YFP. Next, for MitoTracker Deep Red, set the excitation laser to 641 and the emission spectra window to 650 to 750 nanometers. Similarly, for TMRE, set the excitation laser to 555 nanometers and the emission spectra window to 557 to 643 nanometers.Begin the image acquisition setting by selecting the Acquisition tab and adjusting the format to 1024 by 1024. Adjust the speed to 600 in the dropdown menu. Then click the Line Average button and from the dropdown menu, select three.Turn bidirectional scanning on and set the phase and zoom factor to 22.61 and 1.50 respectively. Once done, select the cells based on the YFP fluorescent signal by clicking on the YFP setting one and pressing Fast Live. Then adjust the gain and intensity of YFP and then select cells based on the YFP fluorescent signal.To image the DMSO control plate in the TMRE experiment, adjust the gain and intensity of the TMRE signal setting two so that the mitochondrial network intensity is just below saturation. Keep the gain and intensity for TMRE constant. Then adjust the gain and intensity of the MitoTracker setting one so that the mitochondrial network is visible, but dim.Once the gain and intensity settings are complete, click Start to acquire an image. Acquire images of 20 cells per experimental condition.

تحضير العينات البيولوجية للفحص المجهري متحد البؤر وإعداد التقاط الصور والتصوير المجهري متحد البؤر

Fluorescence Intensity Quantification of Transfected HeLa Cells Using ImageJ

To measure the fluorescence intensity of the transfected HeLa cells in ImageJ software, click file and select open. In the dialogue box, select the imaging files for the experiment and click okay. Once the bio-formats import options window appears, select split channels and click okay.In tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate, or TMRE experiments, YFP is the first channel, MitoTracker is the second channel and TMRE is the third channel. Adjust the brightness by selecting image, then adjust and then the brightness. Next, load the saved region of interest or ROI by clicking analyze, then tools, then ROI manager.In the ROI manager, click more, then open from the list and select the saved ROI. Then measure the fluorescent intensity of five random regions in a single cell by selecting the saved ROI from the ROI manager and moving the ROI to a random location within a cell. To measure the fluorescence intensity, press M on the keyboard and repeat this with four additional non-overlapping regions.When a dialogue box with the area and mean gray values appears, copy and paste the values into a spreadsheet for analysis. The results for the TMRE and MitoSOX fluorescence intensities showed that their treatment with the known uncoupling agent CCCP decreased the TMRE fluorescence intensity compared to the control conditions. In addition, 20 micromolar CCCP treatment induced superoxide production and increased the MitoSOX fluorescence intensity.In mild or five micromolar CCCP stress conditions, the expression of Parkin wild-type and Parkin T240R resulted in higher TMRE intensity compared to the empty YFP control vector. The MitoSOX intensity was lower in cells expressing Parkin wild-type and Parkin T240R compared to cells expressing the YFP control vector suggesting that Parking expression helps maintain the mitochondrial network health by preserving higher mitochondrial membrane potentials and low superoxide levels.