المؤلفون ممتنون لجميع النساء اللواتي وافقن وتبرعن بعينات لهذه الدراسة.

تمت مراجعة محتوى البحث والبروتوكول بشكل أخلاقي والموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى شنتشن تشونغشان لجراحة المسالك البولية. قدمت جميع النساء (20-40 سنة) المشاركات في الدراسة موافقة مستنيرة لجمع العينات واستخدامها.
1. اكتساب الأنسجة المرضية
<ol><li>قم بإعداد أدوات حصاد الأنسجة وهي مسطرة القياس ، والملقط ، وتضمين الكاسيت ، وورق التضمين ، وسلة المناديل.</li>
	<li>لاحظ ما إذا كانت كمية أنسجة بطانة الرحم (أكبر من حبة مونج) ، التي تم جمعها باستخدام نهج قياسي مع قسطرة pipelle ، كافية.</li>
	<li>نقل أنسجة بطانة الرحم من الفورمالين إلى ورقة التضمين مع ملقط وقياس أبعاد أنسجة بطانة الرحم مع المسطرة.</li>
	<li>لف أنسجة بطانة الرحم بورق التضمين وضعها في شريط التضمين.</li>
	<li>ضع علبة التضمين في سلة المناديل للجفاف.</li>
</ol>2. جفاف الأنسجة
<ol><li>ضع سلة الأنسجة في غرفة تفاعل المجفف (انظر جدول المواد) وابدأ إجراء تجفيف الأنسجة الروتيني: الفورمالين لمدة 100 دقيقة ؛ الفورمالين لمدة 100 دقيقة ؛ 75٪ كحول لمدة 60 دقيقة ؛ 85٪ كحول لمدة 60 دقيقة ؛ 95٪ كحول لمدة 60 دقيقة ؛ كحول 100٪ لمدة 60 دقيقة ؛ كحول 100٪ لمدة 60 دقيقة ؛ كحول 100٪ لمدة 60 دقيقة ؛ زيلين لمدة 35 دقيقة ؛ زيلين لمدة 20 دقيقة ؛ زيلين لمدة 20 دقيقة ؛ الشمع لمدة 80 دقيقة ؛ الشمع لمدة 80 دقيقة ؛ الشمع لمدة 80 دقيقة. تستغرق العملية حوالي 15 ساعة.</li>
	<li>في نهاية إجراء تجفيف الأنسجة ، افتح غرفة تفاعل المجفف ، وأزل سلة الأنسجة.</li>
</ol>3. تضمين الأنسجة
<ol><li>أخرج قالب تضمين مناسب وفقا لحجم العينة ، واملأه بشمع البارافين عند 70 درجة مئوية.</li>
	<li>ضع الأنسجة بسرعة في القالب واضبطها بعناية بحيث يقع النسيج في وسط القالب.</li>
	<li>حرك القالب بسلاسة إلى لوحة التبريد واضغط برفق على المنديل بينما يثبت البارافين في الأسفل.</li>
	<li>ضع شريط التضمين أعلى القالب وقم بتعبئته بمزيد من الشمع.</li>
	<li>ضع القالب على لوحة التبريد ، وعندما يتم ترسيخ البارافين تماما ، قم بإزالة الكتلة مع الكاسيت المرفق بها بعيدا عن القالب.</li>
</ol>4. أقسام الأنسجة
<ol><li>أدخل الكتلة على مشبك عينة الميكروتوم ، ضع الشفرة في الحامل ، اضبط الزاوية بين مستوى الكتلة والشفرة ، اضبط سمك القسم إلى 4 ميكرومتر ، أدر عجلة اليد ، وابدأ التقطيع.</li>
	<li>فضح سطح الأنسجة المناسب عن طريق قطع بضعة أقسام رقيقة من الكتلة. أخرج الأقسام المستمرة والكاملة بالفرشاة.</li>
	<li>عندما يتم قطع أقسام كافية ، توقف عن تدوير عجلة اليد ، وقم بإزالة الأقسام غير المؤهلة في الواجهة الأمامية بملاقط ، وقم بتعويم الأقسام على سطح ماء 42 درجة مئوية في حمام مائي بملاقط وفرشاة.</li>
	<li>بعد تسطيح الأقسام بالكامل ، اختر الأقسام الموجودة على الشرائح المضادة للانفصال وانقلها إلى جهاز تدفئة منزلق عند 65 درجة مئوية للخبز لمدة 60 دقيقة.</li>
	<li>عند الانتهاء من الخبز ، أخرج الشرائح الزجاجية من جهاز تدفئة المنزلق.</li>
</ol>5. تلطيخ كيميائي مناعي
<ol><li>تمييع الجسم المضاد الأساسي في حل العمل مع مخفف الأجسام المضادة. انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل.</li>
	<li>ضع محلول الأجسام المضادة المخفف في زجاجة كاشف خاصة ومجموعة الكشف في حجرة الكاشف لأداة تلطيخ IHC الأوتوماتيكية (انظر جدول المواد).</li>
	<li>ضع الشرائح على حامل منزلق ، مغطى بغطاء خاص ، وأدخلها في حجرة التفاعل التجريبي للأداة.</li>
	<li>بعد أن يتعرف الجهاز تلقائيا على الكاشف والمعلومات التجريبية على الشريحة ، انقر فوق الزر "ابدأ " لبدء التلوين الكيميائي المناعي. تستمر التجربة لمدة 3 ساعات.</li>
</ol>6. الجفاف وختم الشريحة
<ol><li>بعد تلطيخ المواد الكيميائية المناعية ، أخرج حامل الشريحة ، واخلع الغطاء الخاص ، وضع الشريحة الملطخة في حامل الشريحة ، واغسل الصبغة المتبقية على الشريحة بالماء النظيف.</li>
	<li>انقل حامل الشريحة إلى شبشب غطاء آلي (انظر جدول المواد) ، وحدد إجراء التجفيف والختم وقم بتشغيله.</li>
	<li>أخرج الشرائح بعد الجفاف والختم.</li>
</ol>7. مسح الشريحة
<ol><li>ضع الشرائح على رف الشرائح الخاص بماسح الصور المرضية البانورامي (انظر جدول المواد) وضعها في حجرة مسح شرائح الجهاز لمسح الصور المرضية البانورامية. يستغرق المسح 2 دقيقة. انظر الشكل 1.</li>
</ol>8. تحليل الصور
<ol><li>استيراد صورة<ol><li>افتح برنامج تحليل الصور المرضية (انظر جدول المواد) وأنشئ مجلدا جديدا. استيراد الصور المناعية الكيميائية لتحليلها.</li>
	</ol></li>
	<li>بناء مصنف الأنسجة<ol><li>ضع علامة على العديد من الأنسجة والتعليق التوضيحي الفارغ لتدريب وإنشاء مصنف لتحديد الأنسجة والمنطقة الفارغة ، على التوالي.</li>
		<li>استخدم الضبط في الوقت الفعلي لمراقبة قدرة التعرف على البرنامج في الوقت الفعلي أثناء التعليق التوضيحي للعلامة. إذا لم يكن التعرف في الوقت المناسب ، فقم بملاحظة التعليق التوضيحي وتدرب مرة أخرى حتى يصبح التعرف على الأنسجة دقيقا.</li>
	</ol></li>
	<li>بناء خوارزمية التحليل<ol><li>حدد الخوارزمية القياسية في البرنامج وفقا لنوع التجربة: تعدد الإرسال IHC.</li>
		<li>اضبط معلمات اللون للتعرف على الخلايا عن طريق تحديد بكسل سلبي وموجب نموذجي. على هذا الأساس ، قم بتعيين معلمات النواة والسيتوبلازم وغشاء الخلية ، ولاحظ حالة التعرف على الخلايا في الوقت الفعلي حتى يتم العثور على المعلمات الأكثر ملاءمة للصورة.</li>
		<li>قم بتعيين عتبة التعرف على الخلايا الإيجابية ولاحظ حالة التعرف في الوقت الفعلي حتى يتم ضبط العتبة المناسبة.</li>
		<li>حدد مصنف الأنسجة في الخوارزمية ، وتحقق من جزء الأنسجة في مصنف الأنسجة ، وذلك لتحديد الخلايا على أساس الأنسجة. في هذه المرحلة ، يتم الانتهاء من إنشاء خوارزمية التحليل.</li>
	</ol></li>
	<li>تشغيل تحليل الصور<ol><li>حدد منطقة التحليل. استخدم الخوارزمية المعمول بها لتحليل الصور.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد الانتهاء من تحليل البرنامج ، تحقق يدويا مما إذا كان التعرف على الصور دقيقا ، بما في ذلك التعرف على الأنسجة والتعرف على الخلايا السلبية والإيجابية.</li>
	<li>إذا لم يكن التعرف على الصورة دقيقا، فاضبط عتبة الخوارزمية والمعلمات مرة أخرى، وأعد تشغيل تحليل الصورة حتى النجاح. تصدير نتائج التحليل. انظر الشكل 1.</li>
	<li>يمكن أيضا تحليل الخلايا المناعية الأخرى وفقا للخطوات المذكورة أعلاه (انظر الشكل 1). تعيين معلمات تحليل مختلفة وفقا للتعبير الفعلي لعلامات المناعة البطانية المختلفة (خلايا CD56 + uNK ، Foxp3 + Tregs ، CD68 + البلاعم ، الضامة CD163 + M2 ، CD1a + DCs وخلايا CD8 + T25،26).</li>
	<li>من خلال حساب البرنامج ، احصل على نسبة الخلايا المناعية البطانية (انظر الجدول 2). استخدم هذا لتقييم مستويات الخلايا المناعية المختلفة في بطانة الرحم للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر.</li>
</ol>

تحليل الصورة لأنسجة بطانة الرحم الملطخة بالأنسجة المناعية الكيميائية

<ol>
	<li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss:+a+committee+opinion.">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li><li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss.">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).</li><li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3,+CD4,+CD8,+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss.">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li><li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells.">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li><li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+percentage+of+CD3(+)T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss.">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li><li>Faas, M. M., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells+and+macrophages+in+pregnancy.">Uterine NK cells and macrophages in pregnancy.</a> Placenta. 56, 44-52 (2017).</li><li>Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variety+of+opportunities+for+immune+interactions+during+trophoblast+development+and+invasion.">A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).</li><li>Meyer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chymase-producing+cells+of+the+innate+immune+system+are+required+for+decidual+vascular+remodeling+and+fetal+growth.">Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth.</a> Scientific Reports. 7, 45106 (2017).</li><li>Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy.">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li><li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+CD56++natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage:+a+histomorphometric+study.">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure:+establishment+of+a+reference+range.">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF.">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li><li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage.">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li><li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriages+and+the+association+with+regulatory+T+cells;+A+systematic+review.">Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review.</a> Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).</li><li>Vallv&#233;-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endometrial+immune+environment+of+women+with+endometriosis.">The endometrial immune environment of women with endometriosis.</a> Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).</li><li>Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Function+and+Composition+Changes+of+Immune+Cells+During+Normal+and+Pathological+Pregnancy+at+the+Maternal-Fetal+Interface.">Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).</li><li>Hey-Cunningham, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+utilizing+flow+cytometry+and+immunohistochemistry+reveals+inflammatory+changes+in+local+endometrial+and+systemic+dendritic+cell+populations+in+endometriosis.">Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis.</a> Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).</li><li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Immune+Infiltration+in+Endometriosis+and+Their+Relationship+to+r-AFS+Stages.">Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages.</a> Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).</li><li>Attems, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+consensus+criteria+for+the+evaluation+of+Lewy+pathology+in+post-mortem+brains:+a+multi-centre+study.">Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study.</a> Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+Assessment+of+Aging-Related+Tau+Astrogliopathy+(ARTAG).">Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG).</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).</li><li>Modis, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+changes+in+corneal+opacification+vary+depending+on+etiology.">Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology.</a> Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quantitative+immunohistochemistry+method+for+precise+protein+measurements+directly+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+specimens:+analytical+performance+measuring+HER2.">A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2.</a> Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).</li><li>Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Immunohistochemistry+and+Digital+Image+Analysis.">Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).</li><li>Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Immune+Cells+in+Recurrent+Spontaneous+Abortion.">The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion.</a> Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).</li><li>Diao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+endometrial+immune+cell-based+score+(EI-score)+for+the+prediction+of+implantation+success+for+patients+undergoing+IVF/ICSI.">New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI.</a> Placenta. 99, 180-188 (2020).</li><li>Hewitt, S. C., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology.+A+hand+to+support+the+implantation+window.">Cell biology. A hand to support the implantation window.</a> Science. 331 (6019), 863-864 (2011).</li><li>Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chorionic+gonadotropin+and+Notch1+in+implantation.">The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Algars, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+and+location+of+tumor-infiltrating+macrophages+and+lymphatic+vessels+predict+survival+of+colorectal+cancer+patients.">Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients.</a> International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).</li><li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma.">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li><li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy.">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li><li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).</li><li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model.">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

أنشأ هذا البروتوكول منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية لمرضى RM كميا. هنا ، تم الكشف عن ست علامات مناعية بطانة الرحم لتقييم البيئة الدقيقة المناعية بطانة الرحم في مرضى RM.
بطانة الرحم الاستقبالية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء هي مفتاح ن...

الإجهاض المتكرر (RM) هو فقدان حملين متتاليين أو أكثر وهو مرض معقد يجذب انتباه الأطباء في السنوات الأخيرة. معدل حدوث RM في النساء في سن الإنجاب هو 1٪ -5٪ 1. تظهر نتائج الدراسات السابقة أن العوامل المناعية ترتبط ارتباطا وثيقا بالتسبب في RM2،3،4،5. الحفاظ على التوازن المناعي في واجهة الأم والجنين مطلوب لزرع الجنين وتطوره. تؤدي الخلايا المناعية البطانية الرحمية عدة أدوار تنظيمية للحفاظ على هذا التوازن ، مثل تعزيز غزو الأرومة الغاذية ، وإعادة تشكيل الشرايين الحلزونية ، والمساهمة في نمو المشيمة6،7،8،9.
تم الإبلاغ سابقا عن خلايا مناعية بطانة الرحم الشاذة لدى النساء المصابات ب RM. تظهر النتائج ارتباطا وثيقا بين الكثافة العالية للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNKs) وحدوثRM 10،11،12. تم الإبلاغ عن عدد متزايد من البلاعم في بطانة الرحم للنساء المصابات ب RM ، مقارنة بأولئك الذين ولدوا أحياء13. تلعب الخلايا التائية التنظيمية (Treg) دورا في تحمل الأم المناعي تجاه الجنين ، وينخفض مستواها ووظيفتها في نفضي مرضى RM14. تلعب الخلايا التائية السمية الخلوية (CTL) والخلايا المتغصنة (DCs) أيضا دورا في التنظيم المناعي للحمل15,16. لذلك ، يمكن أن يساعد التحليل الكمي الشامل للخلايا المناعية البطانية المحلية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء على فهم التسبب في RM بشكل أفضل. تستخدم بعض الطرق الحالية للتحليل الكمي للخلايا المناعية البطانية قياس التدفق الخلوي الذي يمكنه تسمية الخلايا المناعية بدقة بعلامات متعددة17,18. ومع ذلك ، فإن التطبيق السريري لقياس التدفق الخلوي محدود لأنه لا يمكن إجراؤه إلا على الأنسجة الطازجة. لا يمكن الحصول على أنسجة جديدة إلا عند توفر كمية كبيرة من الورم الزائد ، وهو أمر نادر الحدوث لبطانة الرحم. يمكن للكيمياء الهيستولوجية المناعية مراقبة مورفولوجيا الأنسجة جيدا في الموقع ويمكنها أيضا تسمية الخلايا المناعية المختلفة ، في حين أن التقنيات الكيميائية المناعية التقليدية لا يمكنها إجراء تحليل كمي للخلايا المناعية.
بالمقارنة مع تجارب الكيمياء المناعية التقليدية ، فإن التحليل الكيميائي المناعي الكمي للخلايا المناعية في بطانة الرحم له أهمية سريرية مهمة. عادة ما يتم تصنيف درجات كثافة IHC على مقياس من أربع نقاط أو قوي وضعيف في التشخيص المرضي والبحوث19،20،21. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية شبه الكمية ذاتية وغير دقيقة إلى حد كبير ، وتوضح تباينا كبيرا داخل المراقب وبينالمراقبين 22. أحد الحلول الممكنة هو تطبيق التعلم الآلي ، وهو تحليل الصور الرقميةالقيمة 23,24. من خلال توفير قياسات كمية ، يتيح هذا النهج تقييما أكثر دقة لتسلل الخلايا المناعية وتوزيعها وكثافتها داخل أنسجة الرحم. يمكن أن تساعد هذه المعلومات الكمية في توضيح التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا المناعية أثناء دورة الطمث وفي الحالات المرضية المختلفة. بشكل عام ، توفر القدرة على التحليل الكمي للخلايا المناعية في بطانة الرحم من خلال الكيمياء الهيستولوجية المناعية رؤى قيمة في البيئة المكروية المناعية للرحم.
لذلك ، يهدف البروتوكول إلى تطوير والتحقق من صحة منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية الرحمية كميا بما في ذلك خلايا uNK و Tregs والبلاعم و DCs والخلايا التائية السامة للخلايا خلال المرحلة المتوسطة الصفراء في مرضى RM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

لتقييم البيئة الدقيقة المناعية لبطانة الرحم للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر (RM) ، تم تطوير منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية المناعية والتحقق من صحتها لتحليل الخلايا المناعية البطانية كميا خلال المرحلة المتوسطة الصفراء. تم جمع جميع عينات بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء من الدورة الشهرية. تم تقسيم أنسجة بطانة الرحم المضمنة في البارافين إلى شرائح بسمك 4 ميكرومتر ، وتم إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) للكشف عن الخلايا المناعية البطانية الرحمية ، بما في ذلك خلايا CD56 + uNK ، و Foxp3 + Tregs ، و CD163 + M2 البلاعم ، و CD1a + DCs ، وخلايا CD8 + T. تم مسح الشرائح البانورامية ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح وتم استخدام نظام تحليل الصور التجارية للتحليل الكمي. تم حساب النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية بقسمة عدد الخلايا المناعية في إجمالي خلايا بطانة الرحم. باستخدام نظام تحليل الصور التجارية ، يمكن تحليل التقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية الرحمية ، والتي يصعب أو يستحيل تحليلها باستخدام تحليل الصور التقليدي ، بسهولة وبدقة. يمكن تطبيق هذه المنهجية لتوصيف البيئة المكروية بطانة الرحم كميا ، بما في ذلك التفاعل بين الخلايا المناعية ، وعدم تجانسها لمرضى الفشل التناسلي المختلفين. قد تكون منصة التقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية ذات أهمية سريرية مهمة لتشخيص وعلاج مرضى RM.

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير علم المناعة الإنجابية مع بروتوكول للتقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية 

منصة للكشف الكمي عن الخلايا المناعية البطانية على أساس الكيمياء المناعية وتحليل الصور الرقمية

Currently, it is challenging to stabilize the analysis within a certain range. It is also difficult to maintain the quality control of the experiment. Our research can help the patients with abnormal endometrial sensitivity in immune to find the cause of reproductive failure.The local proportion of immune cells in the endometrial can be stably and repeatedly detected. Our findings may promote the research progress of the endometrial sensitivity evaluation in patients with repeated implantation failure.

من أجل تقييم الخلايا المناعية البطانية كميا وتقليل عدم الاستقرار الناجم عن الأخطاء التشغيلية التي من صنع الإنسان ، أنشأنا منصة تحليل كمي رقمية للخلايا المناعية البطانية باستخدام الكشف المناعي الكيميائي التلقائي ونظام التقييم الكمي الرقمي. تم إنشاء منصة تحليل صور الكيمياء المناعية لتحل...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells at JoVE.com

هنا ، تم تطوير منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية والتحقق من صحتها لتحليل الخلايا المناعية البطانية للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر في نافذة الزرع كميا.

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

في الوقت الحالي ، من الصعب تثبيت التحليل ضمن نطاق معين. من الصعب أيضا الحفاظ على مراقبة جودة التجربة. يمكن أن يساعد بحثنا المرضى الذين يعانون من حساسية بطانة الرحم غير الطبيعية في المناعة للعثور على سبب الفشل التناسلي.يمكن اكتشاف النسبة المحلية للخلايا المناعية في بطانة الرحم بشكل ثابت ومتكرر. قد تعزز النتائج التي توصلنا إليها التقدم البحثي لتقييم حساسية بطانة الرحم لدى المرضى الذين يعانون من فشل الزرع المتكرر.

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

765 Views.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. في الوقت الحالي ، من الصعب تثبيت التحليل ضمن نطاق معين. من الصعب أيضا الحفاظ على مراقبة جودة التجربة. يمكن أن يساعد بحثنا المرضى الذين يعانون من حساسية بطانة الرحم غير الطبيعية في المناعة للعثور على سبب الفشل التناسلي.يمكن اكتشاف النسبة المحلية للخلايا المناعية في بطان...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير علم المناعة الإنجابية مع بروتوكول للتقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية 

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze endometrial immune cells during the mid-luteal phase. All endometrium samples were collected during the mid-luteal phase of the menstrual cycle. Paraffin-embedded endometrial tissues were sectioned into 4 &#181;m thick slides, and immunohistochemistry (IHC)staining was carried out for detecting endometrial immune cells, including CD56+ uNK cells, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 macrophages, CD1a+ DCs, and CD8+ T cells. The panoramic slides were scanned using a digital slide scanner and a commercial image analysis system was used for quantitative analysis. The percentage of endometrial immune cells was calculated by dividing the number of immune cells in the total endometrial cells. Using the commercial image analysis system, quantitative evaluation of endometrial immune cells, which are difficult or impossible to analyze with conventional image analysis, could be easily, and accurately analyzed. This methodology can be applied to quantitatively characterize the endometrium microenvironment, including interaction between immune cells, and its heterogeneity for different reproductive failure patients. The platform for quantitative evaluation of endometrial immune cells may be of important clinical significance for the diagnosis and treatment of RM patients.

Here, a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze the endometrial immune cells of patients with recurrent miscarriages in the window of implantation.

Dehydration of Human Endometrial Tissue for Sectioning

To begin, use tweezers to transfer the endometrial tissue from the formalin onto the embedding paper. With a ruler, measure the dimensions of the endometrial tissue. Now wrap the tissue in the embedding paper and place it into an embedding cassette.Transfer the cassette into the tissue basket for dehydration. To dehydrate the endometrial tissue, place the tissue basket in the reaction chamber of the dehydrator and initiate the procedure for routine tissue dehydration. Once the dehydration is complete, open the reaction chamber of the dehydrator and remove the tissue basket.

جفاف أنسجة بطانة الرحم البشرية للتقسيم

Human Endometrial Tissue Embedding and Sectioning for Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

To begin, select an appropriate embedding mold that matches the size of the dehydrated endometrial specimen. Fill it with paraffin wax, heated at 70 degrees Celsius. Immediately place the dehydrated human endometrial tissue in the mold.Use forceps to carefully adjust the tissue, to ensure it is placed centrally. Now, transfer the mold to the cooling plate and gently press the tissue with tweezers as the paraffin at the bottom solidifies. Place the embedded cassette over the mold, and top it with more wax.Then place the mold back on the cooling plate. Once the paraffin has solidified completely, remove the block and its attached cassette from the mold. For sectioning, insert the block onto the sample clip of the microtome.Place the blade into the holder and adjust the angle between the blocks plane and the blade. Now adjust the thickness of the section to four micrometers. Then turn the hand wheel to start slicing.Cut thin sections from the block to expose the appropriate tissue surface. Use the brush to gather the continuous and complete sections. Once enough sections have been obtained, use tweezers to remove the unqualified sections at the front.With a brush, transfer the sections into a warm water bath, heated to 42 degrees Celsius. When the sections have fully flattened out, use anti detachment slides to lift them. Next, bake them in a slide warmer at 65 degrees Celsius for over 60 minutes before removing.

تضمين أنسجة بطانة الرحم البشرية وتقسيمها للكيمياء المناعية وتحليل الصور الرقمية

Tissue Immunohistochemical Staining of Sectioned Human Endometrial Tissue

To begin, transfer the diluted antibody solution into a special reagent bottle. Insert the detection kit into the reagent compartment of an automatic immunohistochemical standing instrument. Next, set the slides with the sectioned endometrial tissue on a slide holder and cover them with a special cover tile.Then insert the holder into the experimental reaction compartment of the instrument. Once the instrument automatically recognizes the information on the reagent and slide, press the start button to initiate the immunohistochemical staining. After staining, take out the slide holder.Put the stained slide into the slide holder to wash off any remaining dye with clean water. Now, place the slide holder onto an automated cover slipper and run the dehydration and sealing procedure. Remove the slides once dehydration and sealing are complete.

تلطيخ الأنسجة المناعية الكيميائية لأنسجة بطانة الرحم البشرية المجزأة

Tissue Scanning and Image Analysis of Immunohistochemically Stained Human Endometrium

To start, place the slides with the immunohistochemically stained endometrial sections on the slide rack of a panoramic pathological image scanner. Then, place the rack in the instrument's slide scanning compartment to initiate scanning. Once scanning is complete, launch the image analysis software and create a new folder.Import the images that require analysis. To build a tissue classifier, mark several tissues along with a blank annotation to establish a classifier that identifies the tissue and blank areas. Use realtime tuning to observe the software's recognition capacity during the mark annotation.To build an analysis algorithm, select the standard multiplex IHC algorithm in the software and choose the negative and positive pixels to set the color parameters of cell recognition. Establish the parameters of the nucleus, cytoplasm, and cell membrane until the optimal parameters for the image are found. Now, set the positive cell recognition threshold and optimize it until an appropriate threshold is obtained.Next, select the tissue classifier in the algorithm. Check the tissue part within it to identify cells based on tissues. Select the analysis area and then use the established algorithm to analyze the images.Once the analysis is complete, manually check the accuracy of tissue recognition, negative and positive recognition. If the image recognition is inaccurate, adjust the algorithm and parameter thresholds again. Run the image analysis until it is successful.Then, export the results of the analysis. Set the different analysis parameters according to the expression of different endometrial immune markers. Use the software to calculate the proportion of endometrial immune cells.Following calculation, use the values to assess the levels of various immune cells in the endometrium of patients with recurrent miscarriage. Different immune cells were immunohistochemically stained based on their individual expression of different markers. The brown stain represents the positive immune cells and the blue represents the nucleus.Different immune cells were expressed in women with recurrent miscarriages. CD56 cells appear to be predominant at 16.76%with CD1a and Foxp3 cells making up 0.11 to 0.12%of the immune cell population.