تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130012 و 81830010) ومشاريع التنشئة للبحوث الأساسية لمستشفى شنغهاي للصدر (رقم المنحة: 2022YNJCQ03).

تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مستشفى شنغهاي للصدر التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم الموافقة: KS23010) وكانت متوافقة مع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. يفضل ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 4-8 أسابيع لهذه التجربة.
1. إعداد الأدوات الجراحية ، والمخازن المؤقتة ، ووسائط الثقافة
<ol><li>أدوات الأوتوكلاف الجراحية (مثل المقص الجراحي والملقط القياسي) عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تطهير الأدوات المجهرية مع الكحول 75 ٪.</li>
	<li>تحضير محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل ب 1٪ v / v بنسلين-ستربتومايسين و 10 مل أخرى من PBS مكملة ب 10٪ v / v بنسلين-ستربتومايسين. ملاحظة: في الأقسام التالية ، إذا لم يتم ذكرها على وجه التحديد ، يشير برنامج تلفزيوني إلى برنامج تلفزيوني معقم منتظم.</li>
	<li>تحضير كريبس رينجر HEPES BSA العازلة: 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، 20 مللي متر HEPES مذاب في محلول كريبس رينجر.</li>
	<li>تحضير محلول هضم طازج: كولاجيناز من النوع 1 (1 مجم / مل) وديباز II (4 مجم / مل) مذاب في محلول كريبس رينجر HEPES BSA. تعقيم الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.</li>
	<li>قم بإعداد صفيحة 12 بئر مغلفة بالكولاجين.<ol><li>خفف محلول الكولاجين (1 مجم / مل) بالماء منزوع الأيونات المعقم إلى تركيز 40 ميكروغرام / مل. أضف 1 مل من محلول الكولاجين المخفف على سطح كل بئر لتحقيق تركيز 6-10 ميكروغرام / سم2. احتضان الطلاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>قم بإزالة المحلول المتبقي وشطف كل بئر 2x مع 1 مل من PBS. استخدم اللوحة على الفور ، أو جفف اللوحة بالهواء في غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية وقم بتخزين اللوحة المطلية عند 2-8 درجة مئوية. عند التخزين ، أغلق الألواح المطلية بالأغشية.</li>
	</ol></li>
	<li>تحضير وسط الثقافة: متوسط النسور المعدلة من Dulbecco عالي الجلوكوز (DMEM) ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.</li>
	<li>تحضير وسط الحث الشحمي: DMEM عالي الجلوكوز ، 10٪ FBS ، 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين ، 1 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين ، 1 ميكرومتر روزيجليتازون ، 1 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي مول 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين (IBMX) ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.</li>
	<li>تحضير وسط الصيانة: DMEM عالي الجلوكوز ، 10٪ FBS ، 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين ، 1 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين ، 1 ميكرومتر روزيجليتازون ، و 1 ميكرومتر أنسولين. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.</li>
</ol>2. تشريح وعزل الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT)
<ol><li>القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم تحت 2 ٪ من التخدير isoflurane أو مع جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون. رش مع الكحول 75 ٪ لتطهير الجلد.</li>
	<li>ضع الماوس في وضع ضعيف (متجها لأعلى).</li>
	<li>ارفع الجلد ، وقم بعمل شق صغير ، وافصل بصراحة بين الجلد وعضلات البطن باستخدام مقص جراحي على طول خط الوسط البطني من الحوض إلى الرقبة. كشف القلب والرئتين عن طريق قطع الحجاب الحاجز والأضلاع على طول جانبي خط الوسط.</li>
	<li>قم بإزالة الكبد والطحال والأمعاء والكلى بعناية. تجنب قطع جدار الأمعاء.</li>
	<li>إزالة الرئتين والمريء.</li>
	<li>ارفع القلب برفق بالملقط في يد وافصل الشريان الأورطي عن العمود الفقري بمقص جراحي في اليد الأخرى. ثم ضع القلب والشريان الأورطي في طبق بتري 60 مم مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ v / v البنسلين والستربتومايسين.</li>
	<li>قم بإزالة ملقط الجراحة المجهرية والمقص المجهري من الكحول واشطفه في 25 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الكحول الزائد. تحت المجهر المجسم ، قم بإزالة الغدة الصعترية والأنسجة الأخرى من القلب والشريان الأورطي ، ثم قم بإزالة القلب ، وترك الشريان الأورطي مع PVATs.</li>
	<li>نقل الشريان الأورطي مع PVATs إلى طبق بتري 60 مم نظيفة مع PBS تحتوي على 1٪ v / v البنسلين الستربتومايسين.</li>
	<li>استخدم ملقط الجراحة المجهرية لتجريد PVATs ، مع زوج واحد من الملقط يثبت الشريان الأورطي والآخر يسحب الأنسجة الدهنية. قم بإزالة الأنسجة الوعائية قدر الإمكان مع تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية.</li>
	<li>اجمع PVAT المحيط بالشريان الأورطي الصدري في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل يحتوي على DMEM عالي الجلوكوز مكمل ب 1٪ v / v البنسلين والستربتومايسين الموضوعة على الجليد.</li>
</ol>3. عزل الكسر الوعائي اللحمي (SVF)
<ol><li>شطف الأنسجة التي تم جمعها بالتتابع مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ v / v البنسلين الستربتومايسين و PBS التي تحتوي على 1٪ v / v البنسلين الستربتومايسين. ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب إجراء جميع التجارب في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية.</li>
	<li>نقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم 60 مم ، إضافة 200 ميكرولتر من محلول الهضم ، وفرمها إلى 1 مم3 قطع باستخدام مقص معقم.</li>
	<li>انقل المزيج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة بلاستيكي ، وتم توسيع النهاية بقطع مقص معقم ، وأضف 6 مل من محلول الهضم لبدء تفاعل الهضم. ملاحظة: تفاعل هضم واحد (3 مل من محلول الهضم) يكفي لمستودعات PVAT من ستة فئران.</li>
	<li>احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع شاكر مداري (تردد 150 دورة في الدقيقة للخلط الفعال) لمدة 30-45 دقيقة. اربط الأنابيب بشكل مسطح على رف لجعل الأنابيب تهتز أفقيا. رج اللوح لأعلى ولأسفل بقوة باليد لمدة 10 ثوان كل 5-10 دقائق. ملاحظة: يمكن إيقاف الهضم عند رؤية سائل هضمي متجانس مصفر مع عدم ترك شظايا الأنسجة.</li>
	<li>قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. شطف مصفاة الخلية مع حجم متساو من وسط الثقافة لزيادة إنتاج الخلايا ووقف عملية الهضم.</li>
	<li>انقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 10 دقائق. اقلب الأنبوب للتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 5 مل من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب وإعادة تعليق الكريات في حجم مناسب من وسط الاستزراع. ملاحظة: يتم إعادة تعليق كريات الخلايا التي تم جمعها من كل ستة فئران في 1 مل من وسط الاستزراع وزرعها في بئر واحدة من صفيحة 12 بئرا.</li>
	<li>بذر الخلايا في صفيحة 12 بئرا مغلفة بالكولاجين واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2 طوال الليل.</li>
	<li>في اليوم التالي ، قم بشفط وسط الاستزراع ، واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) يحتوي على 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين لإزالة بقايا الخلايا وخلايا الدم الحمراء ، وأضف مرة أخرى 1 مل من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر.</li>
</ol>4. الحث الأديبوجيني للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر
<ol><li>قم بتغيير وسط الثقافة كل يوم حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 60-70٪. ملاحظة: عادة ما يستغرق 3-4 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 60-70٪.</li>
	<li>عندما تصل الخلايا إلى التقاء 60-70٪ ، قم باستنشاق وسط الثقافة واستبدله بوسط تحريض دهني بني. النظر في يوم تحريض التمايز adipogenic كما اليوم 0 من التمايز.</li>
	<li>بعد 72 ساعة (اليوم 3 من التمايز) ، قم بتحديث الوسيط بوسيط صيانة. تغيير وسيط الصيانة كل 2 أيام حتى يتم استخدام الخلايا للتجارب.</li>
	<li>تحليل الخلايا الدهنية بطريقة مناسبة ، مثل تلطيخ الزيت الأحمرO 14 والنشاف الغربي15.</li>
</ol>

زراعة الخلايا preadipocytes المعزولة من الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية الفئران

<ol>
	<li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system:+is+fat+always+bad.">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes.">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li><li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction.">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity.">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li><li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue.">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation.">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+sympathetic+nerves+and+inflammation+in+perivascular+adipose+tissue.">Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).</li><li>Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+isolate+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).</li><li>Senesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+enzymatic+procedures+to+isolate+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue:+preliminary+results.">Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).</li><li>Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+technologies+and+clinical+applications.">Stromal vascular fraction technologies and clinical applications.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).</li><li>Suh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+cellular+and+cell-derived+regenerative+therapies+in+dermatology+and+aesthetic+rejuvenation.">Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation.</a> Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).</li><li>Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+adipose+tissue-derivatives+in+modern+dermatology.">Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology.</a> Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).</li><li>Kraus, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture.">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li><li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cort&#233;s, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice.">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methotrexate+improves+perivascular+adipose+tissue/endothelial+dysfunction+via+activation+of+AMPK/eNOS+pathway.">Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).</li><li>Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicle+miR-221-3p+mediates+vascular+remodeling.">Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling.</a> FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).</li><li>Ruan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats.">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li><li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling.">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Stanek, A., Bro&#380;yna-Tkaczyk, K., My&#347;li&#324;ski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+(PVAT)+dysfunction+in+vascular+homeostasis.">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).</li><li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).</li><li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation.">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-&#947;+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis.">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-&#947; deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li><li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm.">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II.">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).</li><li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease.">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation.">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li><li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fern&#225;ndez-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis.">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li><li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice.">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح ، مالية أو غير ذلك ، للإعلان عنها.

نقترح نهجا عمليا وممكنا للعزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر. مزايا هذا البروتوكول هي أنه بسيط واقتصادي. تعد الأعداد الكافية من الفئران ضرورية للعزل الناجح ، حيث يمكن أن تؤدي الأنسجة غير الكافية إلى انخفاض كثافة SVF وضعف حالة النمو ، مما يؤثر ف...

يعتقد أن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، وهي بنية حول الأوعية تتكون من خليط من الخلايا الشحمية الناضجة وجزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، تتفاعل مع جدار الوعاء المجاور عبر إفرازهابشكل شبه مكراني 1. كمنظم حاسم للتوازن الوعائي ، فإن خلل PVAT متورط في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية2،3،4. يتكون SVF لأنسجة الخلايا الشحمية من العديد من مجموعات الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا المناعية وخلايا الظهارة المتوسطة والخلايا العصبية والخلايا الجذعية الدهنية والخلايا السلفية (ASPCs)5,6. من المعروف أن ASPCs المقيمة في SVF للأنسجة الدهنية يمكن أن تؤدي إلى خلايا دهنية ناضجة5. يستدل على SVF ليكون مصدرا مهما للخلايا الشحمية الناضجة في PVAT. أظهرت العديد من الدراسات أن PVAT-SVF يمكن أن يتمايز إلى خلايا دهنية ناضجة في ظل ظروف تحريض محددة6،7،8.
يوجد حاليا نظامان للعزل لعزل SVF عن الأنسجة الدهنية ، أحدهما هو الهضم الأنزيمي والآخر غير الأنزيمي9. تؤدي الطرق الأنزيمية عادة إلى إنتاجية أعلى من الخلايا السلفية النواة10. حتى الآن ، تم إثبات فوائد SVF في تعزيز تجديد الأوعية الدموية والأوعية الدموية الجديدة في التئام الجروح وأمراض الجهاز البولي التناسلي والقلب والأوعية الدموية على نطاق واسع11 ، خاصة في الأمراض الجلدية والجراحة التجميلية12,13. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف آفاق التطبيق السريري ل SVF المشتق من PVAT بشكل جيد ، والذي قد يعزى إلى عدم وجود طريقة موحدة لعزل SVF من PVAT. الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نهج موحد للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من PVAT الفأر المحيط بالشريان الأورطي الصدري ، مما يتيح مزيدا من التحقيق في وظيفة PVAT. يعمل هذا البروتوكول على تحسين معالجة الأنسجة وتقنيات تمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر التي تم الحصول عليها من الفئران الصغيرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>11210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>310109003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2877</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>CT-002-50A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>CST</td>
			<td>4850</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FABP4</td>
			<td>CST</td>
			<td>2120</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PGC1&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191838</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PPAR&#947;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-14889</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-UCP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10983</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Actinin</td>
			<td>CST</td>
			<td>6487</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes</td>
			<td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital shaker</td>
			<td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.</td>
			<td>LYZ-103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (cattle)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11070-73-8</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Pricella&#160;</td>
			<td>PB180347</td>
			<td>protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>A600395-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>B548117-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue

الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) هي مستودع للأنسجة الدهنية يحيط بالأوعية الدموية ويعرض الأنماط الظاهرية للخلايا الشحمية البيضاء والبيج والبني. ألقت الاكتشافات الحديثة الضوء على الدور المركزي ل PVAT في تنظيم التوازن الوعائي والمشاركة في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. إن الفهم الشامل لخصائص PVAT وتنظيمها له أهمية كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية. تعتبر الثقافات الأولية للخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر ذات قيمة لدراسة وظيفة PVAT والحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر والخلايا الوعائية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا اقتصاديا ومجديا للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لنمذجة تكوين الدهون أو تكوين الدهون في المختبر. يحدد البروتوكول معالجة الأنسجة وتمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر من الفئران الصغيرة. سيوفر هذا البروتوكول حجر الزاوية التكنولوجي في جانب مقاعد البدلاء للتحقيق في وظيفة PVAT.

Perivascular adipose tissue (PVAT), a perivascular structure composed of a mixture of mature adipocytes and a stromal vascular fraction (SVF), is believed to interact with the adjacent vessel wall via its secretome paracrineally1. As a critical regulator of vascular homeostasis, PVAT dysfunction is implicated in the pathogenesis of cardiovascular diseases2,3,4. The SVF of adipocyte tissue consists of several expected cell populations, including endothelial cells, immune cells, mesothelium cells, neuronal cells, and adipose stem and progenitor cells (ASPCs)5,6. It is well known that ASPCs residing in the SVF of adipose tissue can give rise to mature adipocytes5. SVF is inferred to be a critical source of mature adipocytes in PVAT. Several studies have shown that PVAT-SVF can differentiate into mature adipocytes under specific induction conditions6,7,8.
Currently, there are two isolation systems for isolating SVF from adipose tissue, one is enzymatic digestion and the other is non-enzymatic9. Enzymatic methods typically result in a higher yield of nucleated progenitor cells10. To date, the benefits of SVF in promoting vascular regeneration and neovascularization in wound healing, urogenital, and cardiovascular diseases have been widely demonstrated11, especially in dermatology and plastic surgery12,13. However, the clinical application prospects of PVAT-derived SVF have not been well explored, which may be attributed to the lack of a standardized method for the isolation of SVF from PVAT. The objective of this protocol is to establish a standardized approach for the isolation, culture, and adipogenic induction of SVF-derived preadipocytes from mouse PVAT surrounding the thoracic aorta, enabling further investigation of PVAT function. This protocol optimizes tissue processing and cell differentiation techniques for culturing periaortic adipocytes obtained from young mice.

تسليط الضوء على المؤلف: أهمية العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية للفأر 

العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا Preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر

We aim to establish a standardized approach for the isolation culture and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mass PVAT. This protocol enables us to conduct further investigations into PVAT function and into the communication between periaortic adipocytes and vascular cells in vitro. The main challenges we currently face in our experiments include the restricted of availability of PVAT and the requirements for additional human and the material resources when compared to using immortalized preadipocytes.Our protocol allows for the study of perivascular adipose tissue function and it's relationship with vascular cells. We also offers a basis for studying PVAT ring and genes, and heterogeneity, and provides a platform for exploring the important regulator of PVAT differentiation and the adipogenesis in vitro.

باستخدام هذا البروتوكول الموصوف أعلاه ، قمنا بعزل PVATs بعناية حول الأبهر الصدري للفأر (الشكل 1A-D). بعد غسل وفرم PVATs إلى قطع صغيرة باستخدام مقص معقم (الشكل 1E ، F) ، تم هضم شظايا الأنسجة في محلول هضم يحتوي على كولاجيناز من النوع الأول (1 مجم / مل) و dispase II (4 ...

Watch this Scientific Journal Video about The Significance of Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of SVF-Derived Preadipocytes from Mouse Perivascular Adipose Tissue at JoVE.com

هنا ، نصف العزلة والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر ، مما يسمح بدراسة وظيفة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية وعلاقتها بالخلايا الوعائية.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

نحن نهدف إلى إنشاء نهج موحد لثقافة العزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من كتلة PVAT. يمكننا هذا البروتوكول من إجراء مزيد من التحقيقات في وظيفة PVAT وفي الاتصال بين الخلايا الشحمية حول الأبهر وخلايا الأوعية الدموية في المختبر. تشمل التحديات الرئيسية التي نواجهها حاليا في تجاربنا تقييد توافر PVAT ومتطلبات الموارد البشرية والمادية الإضافية عند مقارنتها باستخدام الخلايا preadipocytes الخالدة.يسمح بروتوكولنا بدراسة وظيفة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية وعلاقتها بخلايا الأوعية الدموية. كما نقدم أساسا لدراسة حلقة PVAT والجينات ، وعدم التجانس ، ويوفر منصة لاستكشاف المنظم المهم لتمايز PVAT وتكوين الدهون في المختبر.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

1.2K Views.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. نحن نهدف إلى إنشاء نهج موحد لثقافة العزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من كتلة PVAT. يمكننا هذا البروتوكول من إجراء مزيد من التحقيقات في وظيفة PVAT وفي الاتصال بين الخلايا الشحمية حول الأبهر وخلايا الأوعية الدموية في المختبر. تشمل التحديا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: أهمية العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية للفأر 

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Dissection and Isolation of Murine Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Begin by spraying the properly euthanized mouse with 75%alcohol to disinfect the skin. Then place the mouse in a supine position. Lift the skin of the animal's abdominal region, and using surgical scissors, make a small incision in it.Then using the scissors, bluntly separate the skin and abdominal muscles from the pelvis to the neck, along the ventral midline. Expose the heart and lungs by cutting the diaphragm and ribs along both sides of the midline. Next, carefully remove the liver, spleen, bowels, and kidney, avoiding damage to the intestinal wall.Following that, remove the lungs and esophagus. Now gently lift the heart using forceps held in one hand and separate the aorta from the spine with surgical scissors held in the other hand. Then place the heart and aorta in a 60 millimeter petri dish, containing antibiotic supplemented PBS.Retrieve the microsurgical forceps and microsurgical scissors from the alcohol, and rinse them in 25 milliliters of PBS to remove excess alcohol. Working under a stereo microscope, remove the thymus and other tissues from the heart and aorta. Then remove the heart, leaving the aorta with the perivascular adipose tissues or PVATs.Transfer the aorta along with the PVATs to a clean 60 millimeter petri dish containing antibiotic supplemented PBS. Using one pair of microsurgical forceps, hold the aorta, and using another pair, pull off the attached adipose tissues to separate the PVATs from the aorta. Remove as much vascular tissue as possible while causing minimal harm to the PVATs.Finally, transfer the collected PVATs into a two milliliter microcentrifuge tube, containing antibiotic supplemented, high glucose, DMEM, placed on ice.

تشريح وعزل الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية (PVAT)

Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

While working under a class two laminar flow hood, begin by sequentially washing the perivascular adipose tissues or PVATs collected from mice two times. First, using PBS containing 10%penicillin-streptomycin, and, next, using PBS supplemented with 1%penicillin-streptomycin. Transfer the rinsed tissues into a sterile 60-millimeter Petri dish and add 200 microliters of digestion solution to it.Using sterile scissors, mince the tissues into pieces having a dimension of one cubic millimeter. With the help of sterile scissors, cut a plastic pipette tip to broaden its end. Then transfer the minced tissue mix to a 15-milliliter centrifuge tube using the broad-ended pipette tip.Add six milliliters of the digestion solution to the tissues to initiate digestion. After tying the tube horizontally on a rack, incubate it at 37 degrees Celsius in an orbital shaker for 30 to 45 minutes. Every 5 to 10 minutes, remove the tube from the shaker in the incubator and manually shake it up and down vigorously.Pass the digested tissue mix through a 70-micron cell strainer into a 50-milliliter centrifuge tube. Rinse the strainer with an equal volume of culture medium to maximize cell yield and quench digestion. Transfer the filtrate to a new 15-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube to isolate the stromal vascular fraction or SVF. Invert the tube to discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of PBS. Centrifuge the tube again at 1, 800 G for five minutes before discarding the supernatant.Re-suspend the pellet in an appropriate volume of culture medium. Seed the cells into a collagen-coated 12-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius in a humid atmosphere with 5%carbon dioxide. On the next day, remove cell debris and red blood cells by aspirating the culture medium and washing the cells with antibiotic-supplemented PBS pre-warmed to 37 degrees Celsius.Finally, add one milliliter of fresh culture medium to each well, and continue culturing the cells until they reach the desired stage of confluency.