نشكر منصة المختبر ومساعدة معهد الأذن ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج شنغهاي بوجيانغ (22PJ1409200) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 11932012) ؛ مؤسسة البحث العلمي لما بعد الدكتوراه في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ؛ تمويل برنامج البحوث الأساسية لمستشفى الشعب التاسع التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYZZ154).

3D التصور من إعادة عرض العظام تحت الحمل الشد في الفئران توسيع خياطة

<ol>
	<li>Opperman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+sutures+as+intramembranous+bone+growth+sites.">Cranial sutures as intramembranous bone growth sites.</a> Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).</li><li>Thenier-Villa, J. L., Sanrom&#225;n-&#193;lvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ram&#237;rez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incomplete+reossification+after+craniosynostosis+surgery-incidence+and+analysis+of+risk+factors:+a+clinical-radiological+assessment+study.">Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study.</a> Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).</li><li>Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+sagittal+and+lambdoid+craniosynostosis:+open+cranial+vault+expansion+and+remodeling.">Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling.</a> Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).</li><li>Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+craniofacial+sutures:+orthopedic+implications.">Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications.</a> Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).</li><li>Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midpalatal+suture+maturation+method+for+the+assessment+of+maturation+before+maxillary+expansion:+a+systematic+review.">Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review.</a> Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscrew-assisted+rapid+palatal+expander+(MARPE):+the+quest+for+pure+orthopedic+movement.">Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement.</a> Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+suture+regeneration+mitigates+skull+and+neurocognitive+defects+in+craniosynostosis.">Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis.</a> Cell. 184 (1), 243-256 (2021).</li><li>Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+sutures:+Signaling+centres+integrating+mechanosensation,+cell+signaling,+and+cell+differentiation.">Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation.</a> European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suture+provides+a+niche+for+mesenchymal+stem+cells+of+craniofacial+bones.">The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Gli1(+)+suture+stem+cells+to+mechanical+force+upon+suture+expansion.">Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion.</a> Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).</li><li>Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+posterofrontal/sagittal+suture+mesenchymal+cells+in+vitro.">Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+suture+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro.</a> International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).</li><li>Ikegame, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+stress+induces+bone+morphogenetic+protein+4+in+preosteoblastic+and+fibroblastic+cells,+which+later+differentiate+into+osteoblasts+leading+to+osteogenesis+in+the+mouse+calvariae+in+organ+culture.">Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture.</a> Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).</li><li>Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+on+midsagittal+sutural+bone+formation+during+expansion.">Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion.</a> American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).</li><li>Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite+nanoparticles+facilitate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+within+sagittal+suture+during+expansion+in+rats.">Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats.</a> Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).</li><li>Morinobu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopontin+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+during+bone+formation+under+mechanical+stress+in+the+calvarial+suture+in+vivo.">Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo.</a> Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).</li><li>Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cetirizine,+a+histamine+1+receptor+antagonist,+on+bone+remodeling+after+calvarial+suture+expansion.">The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion.</a> Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+application+to+bone+and+dental+tissues.">Tissue clearing and its application to bone and dental tissues.</a> Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+postnatal+craniofacial+bone+development+with+tissue+clearing-based+three-dimensional+imaging.">Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging.</a> Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

قمنا بتطبيق نموذج ماوس تمدد خياطة قياسي لمراقبة التغيرات المورفولوجية المنتظمة التي تحدث كل أسبوع خلال دورة إعادة العرض10 التي تستغرق شهرا كاملا. هذا النموذج مفيد للبحث في إعادة تشكيل العظام القلوية وتجديدها عن طريق توسيع الغرز الكالفارية ، وكذلك لدراسة خلايا خياطة مختلفة <em...

الغرز القحفية الوجهية هي أنسجة ليفية تربط العظام القحفية الوجهية وتلعب أدوارا أساسية في نمو وإعادة تشكيل العظام القحفية الوجهية. يشبه هيكل الخيط النهر ، حيث يوفر تدفقا لموارد الخلايا لتغذية وبناء "ضفة النهر" ، والمعروفة باسم الجبهات العظمية ، والتي تساهم في تكوين العظام القحفية الوجهية عن طريق تكوين العظم داخل الغشاء1.
كان الاهتمام بالخيوط القحفية الوجهية مدفوعا بالاحتياجات السريرية لفهم الإغلاق المبكر للخيوط القحفية وخلل خياطة الوجه ، مما قد يؤدي إلى تشوهات قحفية وجهية وحتى حالات تهدد حياة الأطفال. يستخدم استئصال الخياطة المفتوحة بشكل روتيني في العلاج السريري ، لكن المتابعة طويلة المدى أظهرت تكرار إعادة التعظم غير الكامل في بعض المرضى2. قد يوفر حج القحف طفيف التوغل بمساعدة نوابض التمدد أو استئصال القحف الشريطي بالمنظار طريقة أكثر أمانا للحفاظ على الخيط المحتمل بدلا من التخلص من الأنسجة3. وبالمثل ، تم استخدام علاجات العظام مثل أقنعة الوجه وأجهزة التوسيع على نطاق واسع لعلاج نقص تنسج الفك العلوي السهمي أو الأفقي ، مع بعض الدراسات التي تمدد الحد العمري لعلاج المرضى البالغين عبر موسعات حنكية صغيرة بمساعدة اللولب4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تجديد خياطة الجمجمة بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) جنبا إلى جنب مع المواد القابلة للتحلل هو علاج محتمل في المستقبل ، ويقدم اتجاها جديدا لعلاج الأمراض ذات الصلة7. ومع ذلك ، فإن عملية الوظيفة أو الآلية التنظيمية للخيوط الجراحية لا تزال بعيدة المنال.
تتكون إعادة تشكيل العظام بشكل أساسي من التوازن بين تكوين العظام الذي تجريه بانيات العظم وارتشاف العظام الذي تجريه الخلايا الآكلة للعظم ، حيث يلعب التمايز العظمي للخلايا الجذعية التي تحفزها الإشارات الميكانيكية دورا مهما. بعد عقود من البحث ، وجد أن الغرز القحفية الوجهية عبارة عن منافذ للخلايا الجذعية الوسيطة عالية البلاستيك8. الخلايا الجذعية المخيطة (SuSCs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الجذعية ، تنتمي إلى الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) أو الخلايا الجذعية العظمية (SSCs). يتم تصنيف SuSCs في الجسم الحي بأربع علامات ، بما في ذلك Gli1 و Axin2 و Prrx1 و Ctsk. Gli1 + SuSCs ، على وجه الخصوص ، تحققت بدقة من الخصائص البيولوجية للخلايا الجذعية ، ليس فقط إظهار تعبير عال عن علامات MSC النموذجية ولكن أيضا إظهار إمكانات عظمية وغضروفية ممتازة9. أظهرت الأبحاث السابقة أن Gli1 + SuSCs تساهم بنشاط في تكوين عظام جديدة تحت قوة الشد ، وتحديدها على أنها مصدر الخلايا الجذعية للخياطة التي تدعم تكوين العظم10.
في الماضي ، تمت دراسة الخصائص الميكانيكية الواسعة للخلايا الجذعية في المختبر عبر Flexcell ، والانحناء رباعي النقاط ، ونظام تحميل المغناطيس الدقيق ، وغيرها. على الرغم من أنه تم تحديد خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من خياطة الجمجمة للفأر في المختبر11 ، كما تم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مؤخرا12 ، إلا أن الاستجابة الميكانيكية الحيوية لخلايا الخياطة لا تزال غير واضحة في النظام في المختبر. لمزيد من التحقيق في عملية إعادة تشكيل العظام ، تم إنشاء نموذج تمدد خياطة يعتمد على ثقافة أعضاء كالفاريا المعزولة ، مما يمهد الطريق لإنشاء نموذج مفيد لتوسيع خياطة الجسم الحي 1،13. كانت الأرانب14 والفئران15 أكثر استخداما في الأبحاث الأساسية لتوسيع الخياطة. ومع ذلك ، فإن الفئران هي نماذج حيوانية مفضلة لاستكشاف الأمراض البشرية بسبب جينومها المتماثل للغاية مع البشر ، والعديد من خطوط تعديل الجينات ، وقدرة التهجين الإنجابية القوية. تعتمد نماذج الماوس الحالية لتوسيع خياطة الجمجمة عادة على أسلاك زنبركية تقويم الأسنان المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتطبيق قوة الشد على الخيط السهمي16,17. في هذه النماذج ، يتم عمل فتحتين في كل جانب من العظام الجدارية لإصلاح جهاز التمدد ، ويتم تضمين الأسلاك تحت الجلد ، مما قد يؤثر على وضع تنشيط الخلية.
فيما يتعلق بطريقة التصور ، تم اعتماد الملاحظة ثنائية الأبعاد للشرائح في الاتجاه السهمي بشكل عام لعقود. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن إعادة تشكيل العظام هي عملية ديناميكية ثلاثية الأبعاد معقدة ، أصبح الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد كاملة حاجة ملحة. ظهرت تقنية شفافية الأنسجة PEGASOS لتلبية هذا المطلب18,19. إنه يوفر مزايا فريدة لشفافية الأنسجة الصلبة والرخوة ، مما يتيح إعادة إنتاج عملية إعادة تشكيل العظام الكاملة في مساحة ثلاثية الأبعاد.
للحصول على فهم أعمق وأكثر شمولا للتغيرات الفسيولوجية في فترات إعادة تشكيل العظام ، تم إنشاء نموذج فأر قياسي لتوسيع خياطة السهمي مع إعداد زنبركي بين حاملات مصنوعة يدويا10. من خلال إجراء النقش والترابط الحمضي القياسي ، يمكن ربط جهاز التمدد بقوة بعظم الجمجمة ، مما يولد قوة شد عمودية على الخيط السهمي. علاوة على ذلك ، تم تطبيق طريقة PEGASOS لإزالة الأنسجة بعد وضع العلامات المزدوجة على العظام المعدنية بعد التمدد لتصور تغييرات نمذجة العظام بشكل كامل بعد تمدد الخياطة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Acid etching</td>
			<td>Xihubiom</td>
			<td>E10-02/1807011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUSTRALIAN WIRE</td>
			<td>A.J.WILCOCK</td>
			<td>0.014&#39;&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate, anhydrous</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A603008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamometer</td>
			<td>Sanliang</td>
			<td>SF-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E104152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-MMA 500</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meters</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring</td>
			<td>TAOBAO</td>
			<td>0.2*1.5*1*7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-Cyanine3 azide</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>360538&#160;</td>
			<td>Protect from light. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transbond MIP 
			Moisture Insensitive Primer</td>
			<td>3M Unitek</td>
			<td>712-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transbond XT 
			Light Cure Adhesive Paste</td>
			<td>3M Unitek</td>
			<td>712-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500027</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3-d visualization technique for bone remodeling in a suture expansion mouse model

تلعب الغرز القحفية الوجهية دورا حاسما يتجاوز كونها مفاصل ليفية تربط العظام القحفية الوجهية. كما أنها بمثابة المكانة الأساسية لنمو عظام الجلجلة والوجه ، حيث تحتوي على الخلايا الجذعية الوسيطة وأسلاف العظام. نظرا لأن معظم العظام القحفية الوجهية تتطور من خلال التعظم داخل الغشاء ، فإن المناطق الهامشية للخيوط تعمل كنقاط بدء. نظرا لهذه الأهمية ، أصبحت هذه الغرز أهدافا مثيرة للاهتمام في علاجات العظام مثل توسيع قبو الجمجمة بمساعدة الربيع ، والتوسع السريع في الفك العلوي ، وإطالة الفك العلوي. تحت قوة تتبع العظام ، يتم تنشيط الخلايا الجذعية الغرز بسرعة ، لتصبح مصدرا ديناميكيا لإعادة تشكيل العظام أثناء التوسع. على الرغم من أهميتها ، لا تزال التغيرات الفسيولوجية خلال فترات إعادة تشكيل العظام غير مفهومة بشكل جيد. طرق التقسيم التقليدية ، في المقام الأول في الاتجاه السهمي ، لا تلتقط التغييرات الشاملة التي تحدث في جميع أنحاء الخيط بأكمله. أنشأت هذه الدراسة نموذجا قياسيا للفأر لتوسيع خياطة السهمي. لتصور تغييرات إعادة تشكيل العظام بشكل كامل بعد توسع الخياطة ، تم دمج طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS مع تلطيخ EdU الكامل والملصقات المزدوجة المخلبة بالكالسيوم. سمح ذلك بتصور الخلايا المتكاثرة للغاية وتكوين عظام جديدة عبر عظام الجلاد بأكملها بعد التوسع. يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع خياطة وطريقة تصور 3-D ، مما يلقي الضوء على التغيرات الميكانيكية البيولوجية في الغرز وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.

Craniofacial sutures are fibrous tissues that connect craniofacial bones and play essential roles in the growth and remodeling of craniofacial bones. The structure of the suture resembles a river, providing a flow of cell resources to nourish and build the &#34;river bank&#34;, known as the osteogenic fronts, which contribute to the formation of craniofacial bones via intramembranous osteogenesis1.
Interest in craniofacial sutures has been driven by clinical needs to understand premature closure of cranial sutures and facial suture dysfunction, which may lead to craniofacial deformities and even life-threatening conditions in children. Open suturectomy is routinely used in clinical treatment, but long-term follow-up has shown incomplete re-ossification recurrence in some patients2. Minimally invasive craniotomy assisted by expansion springs or endoscopic stripe craniectomy may provide a safer approach to preserving the potential suture rather than discarding the tissues3. Similarly, orthopedic therapies such as facemasks and expansion appliances have been widely used to treat sagittal or horizontal maxillary hypoplasia, with some studies extending the age limitation to treat adult patients via miniscrew-assisted palatal expanders4,5,6. Additionally, cranial suture regeneration with mesenchymal stem cells (MSCs) combined with biodegradable materials is a potential therapy in the future, offering a novel direction for the treatment of related diseases7. However, the function process or regulatory mechanism of sutures remains elusive.
Bone remodeling mainly consists of a balance between bone formation conducted by osteoblasts and bone resorption conducted by osteoclasts, where osteogenic differentiation of stem cells stimulated by mechanical signals plays an important role. After decades of research, it has been found that craniofacial sutures are highly plastic mesenchymal stem cell niches8. Suture stem cells (SuSCs) are a heterogeneous group of stem cells, belonging to mesenchymal stem cells (MSCs) or bone stem cells (SSCs). SuSCs are labeled in vivo by four markers, including Gli1, Axin2, Prrx1, and Ctsk. Gli1+ SuSCs, in particular, have strictly verified the biological characteristics of stem cells, not only exhibiting high expression of typical MSC markers but also demonstrating excellent osteogenic and chondrogenic potential9. Previous research has shown that Gli1+ SuSCs actively contribute to new bone formation under tensile force, identifying them as the suture stem cell source supporting distraction osteogenesis10.
In the past, extensive mechanical characteristics of stem cells were studied in vitro via Flexcell, four-point bending, micro-magnet loading system, and others. Although mouse cranial suture-derived mesenchymal cells have been identified in vitro11, and human suture mesenchymal stem cells have also been isolated recently12, the biomechanical response of suture cells remains unclear in the in vitro system. To further investigate the bone remodeling process, a suture expansion model based on isolated calvaria organ culture has been established, paving the way for establishing a useful in vivo suture expansion model1,13. Rabbits14 and rats15 have been the most widely used animals in basic research for suture expansion. However, mice are preferred animal models for exploring human disease due to their highly homologous genome with humans, numerous gene modification lines, and strong reproductive hybridization ability. Existing mouse models of cranial suture expansion typically rely on stainless steel orthodontic spring wires to apply tensile force to the sagittal suture16,17. In these models, two holes are made in each side of the parietal bones to fix the expansion device, and the wires are embedded under the skin, which may affect the cell activation mode.
Regarding the visualization method, the two-dimensional observation of slices in the sagittal direction has been generally adopted for decades. However, considering that bone remodeling is a complex three-dimensional dynamic process, obtaining complete three-dimensional information has become an urgent need. The PEGASOS tissue transparency technique emerged to meet this requirement18,19. It offers unique advantages for the transparency of hard and soft tissues, enabling the complete bone remodeling process to be reproduced in three-dimensional space.
To gain a deeper and more comprehensive understanding of the physiological changes in the bone remodeling periods, a standard sagittal suture expansion mouse model with a spring setting between the handmade holders was established10. With a standardized acid etching and bonding procedure, the expansion device could be firmly bonded to the cranial bone, generating a tensile force perpendicular to the sagittal suture. Furthermore, the PEGASOS tissue clearing method was applied after double labeling of the mineralized bone post-expansion to fully visualize the bone modeling changes after suture expansion.

تسليط الضوء على المؤلف: تقنية PEGASOS لإزالة الأنسجة لتصور إعادة تشكيل العظام 

تقنية التصور 3-D لإعادة عرض العظام في نموذج الماوس توسيع خياطة

The interest in craniofacial sutures has been driven by the clinical needs to understand the mechanisms of orthodontic and the orthopedic treatment. The scope of our study is to establish a standardized suture expansion mouse model, and the 3D visualization method to study the mechanobiological changes of suture and bone remodeling upon expansion. PEGASOS tissue clearing technique has been combined with various labeling methods to obtain versatile information of suture and bond remodeling in space perspective.This model is suitable for various strengths of transgenic mice of different age. It is convenient to adjust the magnitude of tensile stress and withdraw force at any time. With the PEGASOS technique, we can observe the three dimensional spatial temporal distribution of cranial suture stem cells during bone remodeling.With the PEGASOS technique, we will further explore the relationship between suture stem cells and mechanical stress, as well as its specific mechanisms.

باستخدام هذا البروتوكول ، تم إنشاء نموذج ماوس لتوسيع خياطة السهمي (الشكل 1-2). لتصور 3-D من تغييرات نمذجة العظام بعد توسيع خياطة ، تم تطبيق طريقة PEGASOS لإزالة الأنسجة على عظام calvarial بأكملها بعد التوسع. بعد التروية ، تم فصل عظام الجلاد (الشكل 3 أ) ...

Watch this Scientific Journal Video about PEGASOS Tissue Clearing Technique to Visualize Bone Remodeling at JoVE.com

يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع الخياطة وطريقة تصور 3-D لدراسة التغيرات الميكانيكية البيولوجية للخياطة وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.

Craniofacial sutures play a crucial role beyond being fibrous joints connecting craniofacial bones; they also serve as the primary niche for calvarial and ...

كان الاهتمام بالخيوط القحفية الوجهية مدفوعا بالاحتياجات السريرية لفهم آليات تقويم الأسنان وعلاج العظام. نطاق دراستنا هو إنشاء نموذج موحد لفأر توسيع خياطة ، وطريقة التصور 3D لدراسة التغيرات الميكانيكية البيولوجية للخياطة وإعادة تشكيل العظام عند التوسع. تم دمج تقنية PEGASOS لإزالة الأنسجة مع طرق وضع العلامات المختلفة للحصول على معلومات متعددة الاستخدامات عن إعادة تشكيل الخيوط والروابط في منظور الفضاء.هذا النموذج مناسب لنقاط القوة المختلفة للفئران المعدلة وراثيا من مختلف الأعمار. من الملائم ضبط حجم إجهاد الشد وسحب القوة في أي وقت. باستخدام تقنية PEGASOS ، يمكننا ملاحظة التوزيع الزماني المكاني ثلاثي الأبعاد للخلايا الجذعية لخياطة الجمجمة أثناء إعادة تشكيل العظام.باستخدام تقنية PEGASOS ، سنستكشف العلاقة بين الخلايا الجذعية المخيطة والإجهاد الميكانيكي ، بالإضافة إلى آلياتها المحددة.

a-3-d-visualization-technique-for-bone-remodeling-suture-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

A 3-D Visualization Technique for Bone Remodeling in a Suture Expansion Mouse Model

984 Views.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. كان الاهتمام بالخيوط القحفية الوجهية مدفوعا بالاحتياجات السريرية لفهم آليات تقويم الأسنان وعلاج العظام. نطاق دراستنا هو إنشاء نموذج موحد لفأر توسيع خياطة ، وطريقة التصور 3D لدراسة التغيرات الميكانيكية البيولوجية للخياطة وإعادة تشكيل العظام عند التوسع. تم دمج تقنية PEGASOS ل?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تقنية PEGASOS لإزالة الأنسجة لتصور إعادة تشكيل العظام 

Craniofacial sutures play a crucial role beyond being fibrous joints connecting craniofacial bones; they also serve as the primary niche for calvarial and facial bone growth, housing mesenchymal stem cells and osteoprogenitors. As most craniofacial bones develop through intramembranous ossification, the sutures' marginal regions act as initiation points. Due to this significance, these sutures have become intriguing targets in orthopedic therapies like spring-assisted cranial vault expansion, rapid maxillary expansion, and maxillary protraction. Under orthopedic tracing force, suture stem cells are rapidly activated, becoming a dynamic source for bone remodeling during expansion. Despite their importance, the physiological changes during bone remodeling periods remain poorly understood. Traditional sectioning methods, primarily in the sagittal direction, do not capture the comprehensive changes occurring throughout the entire suture. This study established a standard mouse model for sagittal suture expansion. To fully visualize bone remodeling changes post-suture expansion, the PEGASOS tissue clearing method was combined with whole-mount EdU staining and calcium chelating double labeling. This allowed the visualization of highly proliferating cells and new bone formation across the entire calvarial bones following expansion. This protocol offers a standardized suture expansion mouse model and a 3-D visualization method, shedding light on the mechanobiological changes in sutures and bone remodeling under tensile force loading.

This protocol presents a standardized suture expansion mouse model and a 3-D visualization method to study the mechanobiological changes of the suture and bone remodeling under tensile force loading.

Sagittal Suture Expansion Surgery to Prepare Mouse Suture Expansion Model

Begin by preparing two retention holders. Use light wire pliers and a 0.014 inch Australian wire to make a helical loop. Then prepare customized stainless steel springs and cut the spring into an appropriate length.Also prepare one straight Australian wire or straight steel wire of length seven millimeters and cut two pieces of paper with diameters of two millimeters to use as barriers. Next, place an anesthetized mouse on the operating table and carefully remove the fur on top of the head with hair removal cream or a shaver. Then disinfect the scalp of the mouse using alternating rounds of Iodoform and 75%alcohol.Position the mouse with its head on the top and use surgical tapes to fix the limbs on the operating table. Now, use surgical scissors to perform an arcuate flap along the scalp near the neck of the mouse, fully exposing the sagittal suture and surrounding skull. Then, fix the scalp flap with a 6-0 suture on the operating table.Dry the skull and etch it with 37%phosphoric acid for 20 seconds. Then use normal saline to clean up the acid etching. Place the two holders on both sides of the parietal bones, three millimeters from the sagittal sutures and glue them with a light cured adhesive.Then put back the scalp flap. Label the position of the holders and cut two small holes in the scalp at the corresponding positions. Reset the flap scalp by simultaneously passing the small loops through the holes to expose the skin surface.To install the spring and guide wire, cut the spring one millimeter longer than the distance between the two holders. Compress the pressure spring and place it between the small coils on both sides. Pass the stainless steel wire through the small coils and the spring and release the spring to obtain a starting thrust of about 30G.Next, place two scraps of paper between the spring and the holders and bond them with a light cured adhesive to set up barriers at both ends of the spring. After expansion, micro CT was used to visualize the changes in the cranial suture. In comparison to controls, the cranial suture gradually and significantly expanded after applying force for one day and fluffy bony protrusions appeared on the bone edge after day five.Also, visualization of mineralization using double labeling method, showed that force loading significantly activated osteogenesis. Newly mineralized bone was observed after seven days, indicating the bone remodeling process after suture expansion.

جراحة توسيع خياطة السهمي لإعداد نموذج توسيع خياطة الفأر

PEGASOS Method to Prepare Transparent Tissues and Calvarial Bones

To begin, fix the limbs of an anesthetized mouse with adhesive tape. Hold the skin of the abdomen upward and carefully cut along the circumference of the thorax to fully expose it. Make a small cut in the right atrium with ophthalmic scissors and immediately insert a perfusion 22 gauge needle at the apex of the left ventricle.Then push 30 to 50 milliliters of cardiac perfusion fluid through the syringe. After the outflow fluid from the right atrium becomes completely clear, infuse an equal volume of 4%PFA solution. Dissect the tissues and organs and fix them overnight with 4%PFA at four degrees Celsius.To induce tissue decalcification. place the fixed heart tissue in 10 milliliters of EDTA solution on a shaking table at 37 degrees Celsius. Incubate for about two days and change the fluid daily.Place the fixed calvaria bones in 20 milliliters of 25%Quadrol solution for tissue decolorization. Incubate on a shaking table at 37 degrees Celsius for one day and change the fluid once. Next, place the tissue sequentially in 30%Tertiary-Butanol or TB solution.Then 50%TB solution, and then 70%TB solution to perform gradient degreasing. Subsequently dehydrate the samples and TB PEG solution for six hours on a shaking table at 37 degrees Celsius. Finally, place the completely dehydrated tissue in BB PEG solution on a shaking table at 37 degrees Celsius.After two to four hours of incubation, the tissue will turn transparent. The PEGASOS Tissue Clearing Method resulted in transparent tissue. Cleared tissue with whole mount EDU staining showed that the labeling was efficient and well preserved.In the control group, several EDU positive cells were diffusely distributed throughout the sutures. After one day of suture expansion, proliferating cells were observed in the middle and edges of the suture. As the suture widened, the number of proliferating cells decreased over time.The green labeled cells were small round cells in the bone marrow, which differed from the EDU positive suture cells.