نشكر الدكتور دانيال هايزنليدر على مساعدته في اختبار طرق تخفيف الدم المختلفة. تم إجراء فحوصات هرمون المصل في مركز جامعة فيرجينيا للأبحاث في فحص وتحليل التكاثر الأساسي بدعم من HD102061 يونيس كينيدي شرايفر NICHD Grant R24. يتم دعم مركز ميشيغان للتنميط الظاهري الأيضي للفأر من قبل NIH Center Grant U2C DK135066. يتم دعم JF و NQ من خلال منح DK020572 (MDRC) و DK089503 (MNORC). يتم دعم CFE و CSM من خلال منحة NICHD R21 HD109485 و R01 HD096324.

تقنية DREADDs وأخذ عينات الدم الآلي

<ol>
	<li>Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+promote+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+congenitally+hypogonadal+(hpg)+male+mice.">Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice.</a> Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).</li><li>Coquelin, A., Desjardins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone+and+testosterone+in+young+and+old+male+mice.">Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).</li><li>Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stalk+portal+blood+collection+in+rhesus+monkeys:+Evidence+for+pulsatile+release+of+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH).">Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH).</a> Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).</li><li>Schuiling, G., Gnodde, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+origin+of+the+pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone+in+long-term+ovariectomized+rats.">Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats.</a> Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).</li><li>Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+lactation-induced+infertility+in+female+mice.">Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice.</a> Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).</li><li>Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+circadian+disruption+on+female+mice+reproductive+function.">Impact of circadian disruption on female mice reproductive function.</a> Endocrinology. 161 (4), (2020).</li><li>Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+Enables+Chronic+Corticosterone+to+Inhibit+Pulsatile+Luteinizing+Hormone+Secretion+and+Suppress+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).</li><li>Moenter, S. M., Evans, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+GnRH+measurements+in+pituitary+portal+blood.">Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood.</a> Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).</li><li>Maeda, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LHRH+pulse+generator:+A+mediobasal+hypothalamic+location.">The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li><li>Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pulsatile+and+surge-like+luteinizing+hormone+secretion+with+frequent+blood+sampling+in+female+mice.">Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).</li><li>Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., P&#233;vet, P., Buijs, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+clock+output+stimulates+melatonin+synthesis+at+night.">Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night.</a> European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).</li><li>Herwig, A., P&#233;vet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-pineal+microdialysis+in+the+Djungarian+hamster+(Phodopus+sungorus):+A+tool+to+study+seasonal+changes+of+circadian+clock+activities.">Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities.</a> Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).</li><li>Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+is+essential+for+the+sexual+dimorphism+of+GH+secretion,+corticosteroid-binding+globulin+production,+and+corticosterone+levels+in+mice.">Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice.</a> Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).</li><li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors.">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li><li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice.">reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Eighth+edition.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition.</a> National Research Council. , (2011).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).</li><li>Peters, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+ABS+Part+I:+Introduction+to+automated+blood+sampling.">Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling.</a> Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).</li><li>Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+Automated+blood+sampler+part+II+Managing+freely-moving+animals+and+monitoring+their+activity.">Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity.</a> Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+ultra-sensitive+ELISA+for+measurement+of+LH+in+mice.">A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice.</a> Endocrinology. 163 (9), (2022).</li><li>Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+acts+directly+and+indirectly+to+increase+gonadotropin-releasing+hormone+neuron+activity+and+its+effects+are+modulated+by+estradiol.">Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol.</a> Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+subpopulations+of+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+female+mice.">Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice.</a> Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 1-8 (2009).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+surge+profiles+of+luteinizing+hormone+secretion+in+the+mouse.">Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+different+roles+of+hypothalamic+kisspeptin+neurons+in+regulating+female+reproduction.">Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction.</a> eLife. 8, 43999 (2019).</li><li>McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+tail-tip+blood+sampling+in+mice+for+the+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).</li><li>Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+glial+fibrillary+acidic+protein+(Gfap)-expressing+cells+in+the+regulation+of+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH)+but+not+arcuate+kisspeptin+neuron+output+in+male+mice.">A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice.</a> eLife. 10, e68205 (2021).</li><li>Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+suppression+of+GnRH+neurons+during+pubertal+development+can+alter+adult+GnRH+neuron+firing+rate+and+reproductive+parameters+in+female+mice.">Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice.</a> eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).</li><li>Talbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Action+of+Tachykinin+Signaling+on+Pulsatile+LH+Secretion+in+Male+Mice.">Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice.</a> Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).</li><li>Tuli, J., Smith, J., Morton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+puberty.">Sleep and puberty.</a> Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 17, 1-7 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من إظهار نبض LH القاعدي وإفراز LH بعد تحفيز مجموعة الخلايا العصبية. المزايا العظيمة للنظام هي البيئة الخالية من الإجهاد التي يتم فيها أخذ العينات ، مع عدم وجود بشري أو التعامل أثناء أخذ عينات الدم. بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن هناك حاجة إلى تدريب حيواني شاق مسبق والتكيف مع الوجود البشري أو التعامل معه أثناء التجربة. تطلبت التجارب السابقة باستخدام أخذ عينات الدم اليدوية قدرا كبيرا من الوقت والجهد لتقليل الضغوطات7،31،32. ومع ذلك ، فإن قطع الذيل وحده هو ضغوط33. قد يكون تنفيذ بيئة غير مرهقة ونموذج تدريب في مرافق المشتركة ، حيث لا يمكن التنبؤ بالانقطاعات ، قيدا أيضا. في بعض المختبرات ، غالبا ما تحتاج إلى نقلها إلى غرف إجراءات بديلة لأخذ عينات الدم. قد تجعل هذه القيود الطريقة اليدوية غير مناسبة للكشف عن التغييرات الطفيفة في مستويات LH ، وبالتالي ، يمكن أن يكون نهج عدم التدخل مفيدا في هذه المواقف. يتم وضع العينات الآلية في غرفة هادئة حيث يتم وضع الفئران قبل عدة أيام للتأقلم مع البيئة الجديدة. قدمت تجربتنا السابقة مع هذا البروتوكول كشفا دقيقا عن أنماط إفراز الكورتيكوستيرون وهرمون النمو النابض في الفئران ، ولم تظهر مستويات مرتفعة من الكورتيكوستيرون أثناء أخذ العينات الآلية15. في التجارب الحالية ، تم تكييف جميع بشكل جيد مع نظام أخذ العينات الذي يظهر بناء العش في غرفة أخذ العينات بعد ~ 24 ساعة ولون الشعر الساطع ، مما يشير إلى نقص الإجهاد والحالة الصحية الجيدة بشكل عام (الشكل 1).
ربما تكون الصعوبة الرئيسية التي تؤدي إلى نتائج سلبية هي الاستهداف غير المناسب ل AAV للسكان الخلايا العصبية المطلوبة. الدقة في الحقن المجسمة أمر ضروري ويجب أن يتم التدريب مسبقا للتحقق من الإحداثيات وأحجام الحقن. يمكن إجراء التدريب عن طريق حقن كمية صغيرة من 0.5-1٪ Evans Blue في الموقع المطلوب في جراحة عدم التعافي ثم أخذ شريحة من الدماغ الذي تم تشريحه حديثا باستخدام مصفوفة دماغ الفأر (على سبيل المثال ، Ted Pella) للتحقق من موقع وحجم الحقن باستخدام مجسم.
من المهم أيضا مراعاة أن الدم والبلازما التي يتم جمعها من نظام أخذ عينات الدم الآلي سيتم تخفيفها في محلول ملحي هيبارين (على سبيل المثال ، 20 ميكرولتر من الدم في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي في نتائجنا)20 ، وقد تحتاج نسبة التخفيف إلى تعديلها لحساسية الطريقة التحليلية المختارة. اختبرنا مستويات الهرمون اللوتيني في الدم الكامل المخفف في BSA-PBS (على النحو الموصى به ل LH ELISA فائق الحساسية)10 أو محلول ملحي ولم نجد أي اختلافات في قيم الهرمون اللوتيني. لا يمكن استخدام توين في المادة المخففة لأن هذا سوف ينتشر في نظام الدم لاستخراج العينات عن طريق استبدال سوائلالعينة 20. في تجربتنا ، أعطت التخفيفات الأقل من 1:10 نتائج جيدة ل LH ولكنها قللت قليلا من مستويات LH مقارنة ب 1: 3.5. يشير هذا إلى أنه يمكن تعديل التخفيف بشكل أكبر لتقليل كمية الدم التي يتم جمعها ، إذا لزم الأمر.
بديل للتسليم الآلي للمركب هو إجراء الحقن اليدوي عبر القسطرة الوريدية. في هذه الحالة ، يكون المحقق حاضرا لفترة وجيزة في الغرفة لتسليم الحقن. ومع ذلك ، لا يوجد اتصال مباشر مع أو مساكنها والمناطق المحيطة بها ، وعلى عكس الحقن داخل الصفاق أو تحت الجلد ، غالبا ما يكون الإجراء بأكمله دون أن يلاحظه أحد. وتتمثل مزايا الحقن اليدوي في أن التخفيف المركب لا يحتاج إلى إعداده مسبقا، وهو ما قد يكون حاسما بالنسبة للمركبات المكلفة للغاية بحيث لا يمكن استخدامها بكميات أكبر أو الحساسة للتحلل بمرور الوقت؛ نظرا لأن حجم التشغيل أصغر منه في التسليم الآلي ، حيث يجب ملء خط التسريب والقسطرة مسبقا بمحلول أكثر مركبا.
يوفر أخذ عينات الدم التلقائي فرصة فريدة لدراسة تغيرات الهرمون اللوتيني أثناء النوم على سبيل المثال. لقد لاحظنا بانتظام التي تنام في أعشاشها أثناء وقت أخذ العينات. من الممكن ربط هذه العينات بتسجيلات EEG لإنشاء تحليل أكثر تفصيلا للعلاقة بين النشاط العصبي ونمط LH34. كما هو موضح هنا ، فإن إمكانيات استخدام أخذ عينات الدم الآلية كثيرة: من أخذ عينات LH القاعدية إلى اختبار استجابة LH للمركبات الداخلية أو الخارجية ، أو لتنشيط أو قمع المجموعات العصبية. يمكن تنفيذ التلاعب بالخلايا العصبية بشكل حاد باستخدام علم الوراثة الكيميائي أو علم البصريات الوراثي ، أو بشكل دائم باستخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا وأدوات إسكات الخلايا المبرمج أو الخلايا العصبية. يسمح أخذ عينات الدم الآلي أيضا بقياس الهرمونات الأخرى ذات الأنماط الإفرازية شديدة النبض (على سبيل المثال ، هرمون النمو15). في إناث الفئران ، إذا كانت هناك حاجة إلى مرحلة معينة من الدورة الشبقية ، يمكن جمع اللطاخات المهبلية بعناية قبل ساعات من بدء البروتوكول26 دون تعطيل خطوط التسريب وأخذ العينات. يمكن توصيل بنظام أخذ العينات لمدة 7-10 أيام مع زيادة خطر تخثر الخط الشرياني مع مرور الوقت.
ومع ذلك ، تقتصر هذه التقنية على الاستخدام في ذات المنزل الواحد ، وبالتالي قد لا تكون مناسبة لدراسة التفاعلات الاجتماعية. كما أنه غازي ويتطلب جراحة صعبة تقنيا ، لذلك قد لا يكون من الممكن تنفيذه مع اليافعة أو نماذج مرضية معينة. أخيرا ، نظرا لأن تكلفة شراء النظام قد تكون مرتفعة للغاية بالنسبة لمختبر أبحاث واحد ، فمن المستحسن إعداده في مختبر أساسي يقدم البروتوكول التجريبي المذكور كخدمات.
في الختام ، يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء التسليم التجسيمي ل AAV جنبا إلى جنب مع أخذ عينات الدم الآلي. إن التحكم المكاني والزماني الدقيق الذي تم تحقيقه باستخدام هذه التقنية ، إلى جانب مرونتها في التطبيق على النماذج المختلفة وبروتوكولات القياس والهرمونات ، يجعلها طريقة قوية لدراسة التنظيم الهرموني في القوارض. الأهم من ذلك ، توفر الطريقة بيئة خالية من الإجهاد من خلال القضاء على الوجود البشري والتعامل معه أثناء الحقن و / أو أخذ العينات ، والتدريب الحيواني المسبق. هذه المزايا ، إلى جانب إمكانية تعدد الإرسال ، تجعل هذه الطريقة أداة فريدة لدراسة التحكم العصبي في التغيرات الهرمونية في الفئران الواعية والمتحركة بحرية وغير المضطربة.

يتم تنظيم محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG) مركزيا من خلال الإطلاق النابض للهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية (GnRH) في نظام بوابة الغدة النخامية. في الغدة النخامية ، يتحكم GnRH في الإطلاق النبضي لموجهة الغدد التناسلية ، والهرمون اللوتيني (LH) ، والهرمون المنبه للجريب (FSH) إلى الدورة الدموية. يعمل إطلاق LH النابض كسمة مميزة لمحور HPG المركزي الذي يعمل1،2،3،4. على سبيل المثال ، يعرض آثار التغيرات الجينية أو التغيرات في العوامل الهرمونية أو البيئية على الجزء العصبي من المحور5،6،7. حتى وقت قريب ، كان قياس نمط نبض LH مقصورا على الثدييات الكبيرة8 والجرذان9 ، نظرا لارتفاع وتيرة أخذ العينات وأحجام الدم الكبيرة اللازمة لتحديد النبضات.
يعد اكتشاف نبضات الهرمون اللوتيني في الفئران أمرا مرغوبا فيه لأن هذا النوع لديه نماذج وراثية واسعة متاحة ويمكن التلاعب به بسهولة باستخدام تقنيات الهندسة الجينومية لمزيد من الدراسة لجينات ومجموعات خلايا معينة. في العقد الماضي ، سمح التقدم الكبير في تحليل تركيزات LH في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم LH (ELISA) باكتشاف LH في كمية دقيقة من الدم10. أتاح تطوير تقنية أخذ عينات الدم المتكررة من طرف الذيل أخذ العينات المتكررة اللازمة للكشف عن تواتر وسعة نبضات LH في الفئران10,11. ومع ذلك ، يقتصر أخذ عينات الدم من طرف الذيل على استخدامه في المستيقظة الواعية. يتطلب فترة تدريب طويلة للفئران للتكيف مع المناولة ووجود محقق معين أثناء أخذ العينات. نجاحها شديد التأثر بالضغوطات البيئية وقد لا يكون مناسبا للاستخدام في سلالات الفئران التي تظهر مستويات عالية من القلق. كما تم استخدام القنية داخل الأذين لأخذ عينات الدم بشكل متكرر في الفئران الواعية التي تتحرك بحرية12. ومع ذلك ، لا يزال هذا الإعداد يتطلب أخذ عينات دم يدوية متكررة ويقيد مساحة حركة ، في حين أن القنية الأذينية يمكن أن تؤدي إلى تغييرات ديناميكية في وظيفة القلب. لذلك من المستحسن إنشاء طريقة لجمع الدم في ظل ظروف خالية من الإجهاد في الفئران الواعية والمتحركة بحرية ودون إزعاج دون الحاجة إلى تدريب مسبق أو التعامل أو الوجود البشري.
تم استخدام أخذ عينات الدم أو الديالة الآلية من قبل لقياس مستويات الهرمونات المختلفة (على سبيل المثال ، الميلاتونين13،14) وإفرازها النابض (على سبيل المثال ، هرمون النمو)15 في القوارض غير المقيدة. نقدم هنا بروتوكولا لأخذ عينات الدم المتكررة على المدى الطويل في الواعية وغير المقيدة ، إلى جانب التنشيط عن بعد في الوقت المناسب لمجموعات عصبية محددة باستخدام تقنيات كيميائية وراثية: المستقبلات المصممة التي يتم تنشيطها حصريا بواسطة الأدوية المصممة (DREADDs). سنصف التوصيل التجسيمي لناقل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) والتنشيط عن بعد عن طريق التوصيل الوريدي الآلي (IV) لأكسيد كلوزابين-ن (CNO)16,17. يسمح هذا البروتوكول بالكشف المتسلسل عن المستويات القاعدية والتغيرات المستحثة في نبض الهرمون اللوتيني في متعددة في نفس الوقت. يتم إجراء كل من أخذ عينات الدم والتسليم الوريدي للمركب بطريقة يتم التحكم فيها بمرور الوقت عبر برنامج كمبيوتر يلغي الوجود المادي للمحقق أو الحاجة إلى تدريب مسبق على الفئران. تتغلب هذه الطريقة على القيود الرئيسية لأخذ عينات الدم اليدوية. يسمح بأخذ عينات الدم في حالة خالية من الإجهاد ، والتسليم المتزامن للمركب الوريدي إلى جانب التحكم في النشاط العصبي عن بعد. نعرض نتائج تمثيلية لاستخدام أخذ عينات الدم الآلي بمفرده أو مع تنشيط الخلايا العصبية عن بعد ونناقش مزاياها وقيودها واستخداماتها الإضافية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>44361</td>
			<td>Not necessarily this virus but this was the one used for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction box</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction machine</td>
			<td>Kent Scientific Equipment</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia masks for mice</td>
			<td>Kent Scientific Equipment</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip applier 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip remover 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclips 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Culex Controller</td>
			<td>Culex</td>
			<td>SN: 2151, 2152, 2156, 2158</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Honey Comb Fraction Collector</td>
			<td>Honey Comb</td>
			<td>SN: 2105, 2106, 2107, 2108</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Ratrun Rotation Control</td>
			<td>RATURN 2</td>
			<td>SN: 5680, 5681, 5682, 5683</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td></td>
			<td>JAX # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>ENZO</td>
			<td>BLM-NS105-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULEX Automated In Vivo Sampling System</td>
			<td>BASi</td>
			<td>DS000627</td>
			<td>with CX-4000S Replacement Tubing Sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>61100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empis control Module</td>
			<td>EMPIS CM</td>
			<td>SN: 174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empis Programmable Infusion System</td>
			<td>EMPIS</td>
			<td>SN: 2125 , 2126, 2127, 2128</td>
			<td>With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envigo 2016 diet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>low-phytoestrogen diet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Petrolatum Ophtalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MIB100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>RS-7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine Surgical scrub</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>Fluriso</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Surgivet or Kent Scientific Corp</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Anesthesia Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice</td>
			<td></td>
			<td>&#160;JAX # 023436 and #024109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kisspeptin-10</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals</td>
			<td>048-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-renathane tubing&#160;</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>Surgical catheterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;RS-7842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter injector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>P30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X2</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-6808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Liveo Laboratory Tubing</td>
			<td>NO.508-001</td>
			<td>0.012 in I.D x 0.025 in O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic table</td>
			<td>RWD</td>
			<td>E06208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades</td>
			<td>SKLAR</td>
			<td>06-3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>f-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>&#160; RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cFos&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABE457</td>
			<td>Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21209</td>
			<td>Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry monoclonal (16D7)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M11217</td>
			<td>Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote neuronal activation coupled with automated blood sampling to induce and measure circulating luteinizing hormone in mice

تعد مستويات هرمون اللوتين (LH) المنتشرة مؤشرا أساسيا لعمل التحكم في الغدة النخامية للتكاثر. لا يزال دور العديد من المدخلات والمجموعات العصبية في تعديل إطلاق LH غير معروف. غالبا ما يمثل قياس التغيرات في مستويات الهرمون اللوتيني في الفئران تحديا لأنها تتعطل بسهولة بسبب الإجهاد البيئي. تتطلب التقنيات الحالية لقياس إطلاق الهرمون اللوتيني والنبض تدريبا طويل الأجل للفئران للتكيف مع إجهاد التلاعب ، وبعض ضبط النفس ، ووجود الباحث ، والعمل على الفردية ، مما يقلل من فائدته للعديد من الأسئلة البحثية.
تقدم هذه الورقة تقنية لتنشيط مجموعات عصبية محددة عن بعد باستخدام تقنية Designer Receptor Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADDs) إلى جانب أخذ عينات الدم المتسلسلة الآلية في الفئران الواعية والمتحركة بحرية وغير المضطربة. نصف أولا بروتوكول الجراحة التجسيمية لتوصيل ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) التي تعبر عن الفزع إلى مجموعات عصبية محددة. بعد ذلك ، نصف بروتوكول الشريان السباتي وقنية الوريد الوداجي والاتصال بعد الجراحة بنظام أخذ عينات الدم الآلي CULEX. أخيرا ، وصفنا بروتوكول الحقن الوريدي clozapine-N-oxide للتنشيط العصبي عن بعد وجمع الدم الآلي. تسمح هذه التقنية بأخذ عينات آلية مبرمجة كل 5 دقائق أو أكثر لفترة معينة ، إلى جانب حقن المواد في الوريد في نقطة زمنية أو مدة مرغوبة. بشكل عام ، وجدنا أن هذه التقنية هي نهج قوي للبحث في التحكم في الغدد الصم العصبية.

The hypothalamo-pituitary-gonadal (HPG) axis is centrally regulated by the pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) into the pituitary portal system. In the pituitary gland, GnRH controls the pulsatile release of gonadotropins, luteinizing hormone (LH), and follicle-stimulating hormone (FSH) to the circulatory system. LH pulsatile release serves as a hallmark for central HPG axis functioning1,2,3,4. For example, it displays the effects of genetic alterations or changes in hormonal or environmental factors on the neural part of the axis5,6,7. Until recently, measuring the LH pulsatile pattern was limited to large mammals8 and rats9, given the high frequency of sampling and large blood volumes necessary to identify the pulses.
Detecting LH pulses in mice is desirable since this species has broad genetic models available and can be readily manipulated using genomic engineering technologies to further study specific genes and cell populations. In the last decade, a large advance in the analysis of LH concentrations in mice using a sandwich LH enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has allowed for detecting LH in a minute amount of blood10. The development of the frequent tail-tip blood sampling technique has made possible the necessary frequent sampling for detecting the frequency and amplitude of LH pulses in mice10,11. However, tail-tip blood sampling is limited to its use in conscious awake animals; it demands a long training period for mice to adapt to the handling and the presence of a designated investigator during sampling. Its success is highly susceptible to environmental stressors and may not be suitable for use in mouse strains showing high levels of anxiety. Intra-atrial cannulation has also been used for frequent blood sampling in freely-moving conscious mice12. However, that setup still requires repeated manual blood sampling and restricts animal moving space, while atrial cannulation can lead to dynamic changes in cardiac function. It is therefore desirable to establish a method for blood collection under stress-free conditions in conscious, freely moving, and undisturbed mice without the need for prior training or human handling or presence.
Automated blood or dialysate sampling has been used before for measuring different hormone levels (e.g., melatonin13,14) and their pulsatile secretion (e.g., growth hormone)15 in unrestrained rodents. We herein present a protocol for automated long-term frequent blood sampling in conscious and unrestrained animals, coupled with a timely remote activation of specific neuronal populations using chemogenetic technologies:&#160;the designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs). We will describe the stereotaxic delivery of an adeno-associated virus (AAV) vector and the remote activation by an automated intravenous (IV) delivery of clozapine-N-oxide (CNO)16,17. This protocol allows for the sequential detection of basal levels and induced changes in LH pulsatility in multiple animals at the same time. Both the blood sampling and the IV delivery of the compound are conducted in a time-controlled manner via a computer program eliminating the physical presence of the investigator or the requirement for prior mouse training. This method overcomes the main limitations of manual blood sampling. It allows for blood sampling in a stress-free condition, and simultaneous IV compound delivery coupled with remote neuronal activity control. We show representative results of the use of automated blood sampling alone or combined with remote neuronal activation and discuss its advantages, limitations, and additional uses.

تسليط الضوء على المؤلف: التسريب الآلي وأخذ عينات الدم للتحليل الهرموني الدقيق في الفئران الواعية

التنشيط العصبي عن بعد إلى جانب أخذ عينات الدم الآلي للحث على قياس هرمون اللوتين المتداول في الفئران وقياسه

Our goal is to understand the role of specific neuron populations in the regulation of the pulsatile secretion of luteinizing hormone. For this, we require precise control of neuron allocation, identity, and activity, in combination with the sequential collection of blood samples without disturbing or stressing the animals. Current method for collecting sequential blood samples in conscious mice are limited to tail cuts, require a long changing period, and are susceptible to human handling and environmental stresses.Automated infusion and blood sampling can be conducted without presence of investigators, which it limits stress and allows for the capture of hormonal changes in conscious, free-moving, and undisturbed mice. This technique is a asset to neuroscience research as it provides a robust support system. The Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center offers automated infusion and broad sampling experiments as a core service.

الخلايا العصبية المعبرة عن Kisspeptin (جين Kiss1) الموجودة في النواة المقوسة لمنطقة ما تحت المهاد هي محفز قوي ل GnRH ، وبالتالي ، من إطلاق LH من الغدة النخامية24,25. في هذا العرض التوضيحي للبروتوكول ، استخدمنا إفراز LH الناجم عن كيسبيبتين لتوضيح عمل تقنية أخذ عينات الدم الآلية. يوضح الشكل 2 أنماط LH التمثيلية في إناث Kiss1-eYFP البالغة التي تلقت سابقا حقنة مجسمة أحادية الجانب من AAV-hM3Dq-mCherry في النواة المقوسة (AP: -4.95 ، ML: -0.35 ، DV: -5.7). تم استخدام ChR2-eYFP كمراسل فلوري لخلايا Kiss1. بعد شهر واحد من الجراحة التجسيمية ، خضعت الفئران للشريان السباتي وقنية الوريد الوداجي وتم توصيلها بجهاز أخذ عينات الدم الأوتوماتيكي بعد 4 أيام من الجراحة. بدأت عمليات جمع الدم لتحديد مستويات الهرمون اللوتيني القاعدي في اليوم التالي بتردد أخذ العينات لمدة 10 دقائق (فاصل زمني قدره 7 دقائق بين العينات و 3 دقائق / أخذ العينات) متبوعا بحقن CNO الوريدي الآلي وأخذ عينات الدم المستمر كل 10 دقائق لمدة 30 دقيقة. مستويات LH المميتة منخفضة بشكل عام (الشكل 2 أ) ، ولكن عادة ما يتم ملاحظة الاختلافات بسبب إطلاقها النابض (الشكل 2 ب). بعد حقن CNO (وتنشيط الخلايا العصبية kisspeptin) ، كان الارتفاع في LH حادا (في غضون 10 دقائق). يعتمد مستوى الزيادة ومدة الذروة على العديد من العوامل ، بما في ذلك موقع الحقن ، وعدد الخلايا العصبية التي تم تنشيطها ، أو السكان المستهدفين.
يوضح الشكل 3 موقع الحقن في الدماغ في النواة المقوسة لأنثى الفأر الممثلة في الشكل 2 أ. يتم تمييز الخلايا العصبية Kiss1-eYFP باللون الأخضر ، بينما يظهر النشاط المناعي mCherry موقع حقن AAV والتنشيط بعد CNO. تم الكشف عن الخلايا العصبية المنشطة باستخدام التفاعل المناعي cFOS ، المسمى ب DAB. تزامنت معظم الخلايا العصبية mCherry مع Kiss1-eYFP ، وأظهر العديد منها تفاعلا مناعيا cFOS ، مما يدل على أن التنشيط الفيروسي والعصبي كان خاصا بالسكان المستهدفين.
يظهر الشكل 4 نمطا نابضا تمثيليا للإفراز LH في الفئران من النوع البري المتوحش (C57BL / 6J) متبوعا بالاستجابة لحقن IP من kisspeptin-10. خضع الفأر لقنية الشريان السباتي وتم توصيله بنظام أخذ عينات الدم التلقائي بعد 4 أيام من الجراحة. في صباح اليوم التالي ، تم فحص الدورات الشحمية وتم إجراء جمع الدم وحقن kisspeptin-10 في اليوم26 الوحشي. تم جمع عينات الدم كل 7 دقائق لمدة 2 ساعة (فاصل زمني 4 دقائق ، بالإضافة إلى 3 دقائق / أخذ العينات لمدة 120 دقيقة قبل الحقن) لتحديد مستويات خط الأساس ونبض LH ، تليها حقنة IP من kisspeptin-10 (65 ميكروغرام / كجم) واستمرار جمع الدم كل 7 دقائق لمدة 30 دقيقة إضافية. لوحظت نبضات LH واضحة نموذجية للإناث في ديستروس ، تظهر مستويات LH القاعدية المنخفضة ، وتردد النبض ~ 2 نبضة / ساعة ، وسعة النبض ~ 1 نانوغرام / مل27. تم الكشف عن زيادة فورية وقوية في LH استجابة لإدارة كيسبيبتين28. تتفق أنماط إفراز الهرمون اللوتيني والتغيرات بعد التحفيز مع دراسات أخرى تستخدم جمع الدم اليدوي10،27،29،30. توضح هذه النتائج أن طريقة أخذ عينات الدم الآلية تلتقط إفراز LH النموذجي والمحفز في ظل ظروف خالية من الإجهاد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig01.jpg"> الشكل 1: تفاصيل نظام الموصل ووصلات الماوس بأنابيب نظام التسريب وأخذ العينات. (أ) موصل أنابيب مطلي بالسيليكون (MASA) تم إنشاؤه باستخدام أنبوبين إبرة 25G وأنبوبين PE-20 ، بأكمام في أنبوب سيلاستيك متصل بحلقة معدنية صغيرة. ب: فأر متصل بأنبوب التسريب وأخذ العينات في قفص أخذ العينات، ويستريح في عشه أثناء أخذ عينات الدم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig02.jpg"> الشكل 2: النتائج التمثيلية لنبضات LH في إناث الفئران Kiss1-Cre المحقونة ب AAV-hM3Dq في النواة المقوسة وتنشيطها عن بعد باستخدام CNO. تم قياس مستويات LH القاعدية كل 10 دقائق لمدة نصف ساعة. في الوقت 0 بعد جمع الدم ، تلقت الأنثى حقنة في الوريد من كلوزابين-N-أكسيد (0.5 ملغم / كغم) واستمر جمع الدم من الشريان السباتي كل 10 دقائق لمدة نصف ساعة إضافية. (أ) يظهر أنثى ذات مستويات LH قاعدية منخفضة. (ب) تظهر أنثى تعرض حقنا أوليا بنبض الهرمون اللوتيني. الاختصارات: Kiss1 = كيسبيبتين. AAV = فيروس مرتبط بالغدي ؛ CNO = كلوزابين-N-أكسيد ؛ LH = هرمون اللوتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig03v2.jpg"> الشكل 3: تنشيط الدماغ في النواة المقوسة ل Kiss1-Cre ؛ Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) أنثى ممثلة في الشكل 2 أ. تم استخدام ChR2-eYFP فقط كجين مراسل لتسمية الخلايا العصبية kiss1. (أ) صورة مضان منخفضة التكبير توضح موقع حقن AAV في النواة المقوسة. الأخضر: النشاط المناعي eYFP ، أرجواني: mCherry المناعي. (ب) صورة حقل ساطع منخفضة التكبير للمنطقة المقابلة للشكل 3 أ ، توضح النشاط المناعي cFOS (أسود) في موقع حقن AAV في نواة Arcuate. (ج) صورة مضان عالية التكبير وصورة برايت فيلد مجتمعة تظهر نظرة فاحصة للخلايا العصبية في الشكل 3 أ ، ب. الخلايا العصبية Kiss1-eYFP التي تعبر عن AAV-mCherry التي تم تنشيطها هي تلك التي تحتوي على سيتوبلازم أبيض ونواة سوداء (أسهم). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (أ ، ب) ، 20 ميكرومتر (ج). الاختصارات: Kiss1 = كيسبيبتين. AAV = فيروس مرتبط بالغدي ؛ eYFP = بروتين فلوري أصفر محسن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig04.jpg"> الشكل 4: نبض LH القاعدي في أنثى من النوع البري الوحشي يقاس كل 7 دقائق لمدة 2 ساعة. ثم تلقت الأنثى حقنة داخل الصفاق من كيسبيبتين -10 (65 ميكروغرام / كجم) في الوقت 0 ، وتم جمع عينات الدم باستمرار كل 7 دقائق لمدة نصف ساعة. اختصار: LH = هرمون اللوتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice at JoVE.com

نبض هرمون اللوتين (LH) هو السمة المميزة للوظيفة الإنجابية. وصفنا بروتوكولا للتنشيط عن بعد لمجموعات عصبية محددة مرتبطة بجمع الدم الآلي التسلسلي. تسمح هذه التقنية بالتعديل الهرموني الموقوت ، وتعدد الإرسال ، وتقليل تأثيرات التلاعب على مستويات LH في الواعية التي تتحرك بحرية ، وغير المضطربة.

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

هدفنا هو فهم دور مجموعات خلايا عصبية معينة في تنظيم الإفراز النابض للهرمون اللوتيني. لهذا ، نحتاج إلى تحكم دقيق في تخصيص الخلايا العصبية وهويتها ونشاطها ، إلى جانب الجمع المتسلسل لعينات الدم دون إزعاج أو إجهادها. تقتصر الطريقة الحالية لجمع عينات الدم المتسلسلة في الفئران الواعية على جروح الذيل ، وتتطلب فترة تغيير طويلة ، وتكون عرضة للتعامل مع الإنسان والضغوط البيئية.يمكن إجراء التسريب الآلي وأخذ عينات الدم دون وجود محققين ، مما يحد من الإجهاد ويسمح بالتقاط التغيرات الهرمونية في الفئران الواعية وحرة الحركة وغير المضطربة. هذه التقنية هي أحد الأصول لأبحاث علم الأعصاب لأنها توفر نظام دعم قوي. يقدم مركز ميشيغان للتنميط الظاهري الأيضي للفأر التسريب الآلي وتجارب أخذ العينات الواسعة كخدمة أساسية.

remote-neuronal-activation-coupled-with-automated-blood-sampling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

828 Views.  University of Michigan, Ann Arbor. هدفنا هو فهم دور مجموعات خلايا عصبية معينة في تنظيم الإفراز النابض للهرمون اللوتيني. لهذا ، نحتاج إلى تحكم دقيق في تخصيص الخلايا العصبية وهويتها ونشاطها ، إلى جانب الجمع المتسلسل لعينات الدم دون إزعاج أو إجهادها. تقتصر الطريقة الحالية لجمع عينات الدم المتسلسلة في الفئران ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التسريب الآلي وأخذ عينات الدم للتحليل الهرموني الدقيق في الفئران الواعية

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

Stereotaxic Delivery of Adeno-Associated Viruses to a Specific Cell Population Linked to Serial Automated Blood Collection

To begin, inject a preemptive analgesic into an anesthetized mouse. Using clippers, shave the head of the mouse. Install the animal on a stereotaxic table and correctly position ear bars.Attach the mouse's mouth to the mouse piece and carefully position the tongue outside to prevent suffocation. After checking the depth of anesthesia, position elevation support beneath the animal to ensure the body and head remain leveled horizontally. And use a warm pad with paper to maintain the animal's temperature.Apply ointment to both eyes to prevent dryness. Then, using iodine and alcohol, disinfect the mouse's head. Use a scalpel to make an incision along the head's midline with the cut stretching from behind the eyes to post the lambda suture.Expose the skull and swab it with a sterile cotton tip saturated in 0.9 sodium chloride solution. Under a stereo microscope, identify the rostral rhinal vein or RRV and use a sterile pencil to mark it. Using a sterile needle as a reference, confirm the orientation of the brain.Ensure no change in the DV and ML coordinates. Next, position a sterile glass pipette containing the virus solution to the RRV reference for zero anteroposterior reference. Advance the pipette along the sagittal suture until reaching the chosen anteroposterior coordinate.Mark this spot with a sterile pencil and lift the needle. Carefully drill a small circle around the marked position to avoid breaking the superior sagittal sinus, and remove the piece of the skull with small forceps. Then, using the superior sagittal sinus median as the mediolateral reference, move the pipette to the position and lower it until it touches the dura mater as the dorsoventral reference.Create a slight break in the dura mater and lower the pipette to the preferred dorsoventral position. Inject the specified quantity of adeno-associated virus or AAV vectors into the brain and remove the pipette. Free the mouse from the ear bars, then close the skin using surgical clips.transition the animal into a separate warmed cage to recover. Keep an eye on the mouse's recovery. Once it regains consciousness, return it to its original enclosure when fully recovered.

التوصيل التجسيمي للفيروسات المرتبطة بالغدي إلى مجموعة خلايا معينة مرتبطة بجمع الدم الآلي التسلسلي

Jugular Vein and Carotid Artery Canulation for Automated Blood Sampling in Mice

To begin, inject the mouse with AAV-associated vectors into the mouse brain. After three to four weeks of virus injection, shave the ventral and back areas of the neck of an anesthetized mouse. Clean the shaved areas using three iodine scrubs in rotation with 70%ethanol solution.Make a ventral incision in the skin between the shoulder blades. Afterward, place surgical gauze over the incision and position the animal in a supine state, with its head facing toward the surgeon. Then make a small vertical incision on the right side of the neck, above the clavicle, to expose the right carotid artery and jugular vein.After separating the subcutaneous tissue, expose the right external jugular vein and place the suture under the vein. Tie off the distal end of the jugular vein to halt the blood flow. Using micro forceps and scissors, make a small incision in the collapsed vein.Now, insert the venous catheter with the bevel facing downward, and move it proximally towards the superior vena cava until it reaches the right atrium. Using a 7-0 silk suture, secure the catheter to the vessel. Dissect the connective tissues to expose the right common carotid artery.Proximally, pre-place two 7-0 silk sutures'suture loops that remain unfastened at the level where the internal and external carotid arteries divide. To stop the blood flow temporarily, pull a pre-placed suture loop. Then, using micro scissors or a 27-gauge needle, create a small opening on the vessel wall.Insert the arterial catheter proximally while releasing the suture loop, and advance the catheter to reach the aorta arch, without touching the aortic valve. Use the two pre-placed sutures to fasten the catheter to the vessel. Tunnel all catheters subcutaneously, exteriorize them at the back of the neck via the pre-cut incision, and close the ventral incision.Join the catheters to the venous or arterial ports of the silicone-coated tubing connector made from 25-gauge needle tubing. After closing the ventral incision, secure the connector subcutaneously when the back skin is sealed with sutures. Using stainless steel surgical wires, fill the catheters with heparinized saline and tightly plug the ends of the catheters.To attach the animal on an automated blood collection system 24 hours postsurgery, connect the tether hook to the metal ring on the back of the neck and connect the arterial line. Once the arterial catheter is connected to the injection line, attach the venous catheters to the sampling lines. Set the injection time and dose at 0.5 milligrams per kilogram at 500 microliters per minute.Set the blood sampling time and frequency, including the sample dilution with saline. The system will automatically replenish an equal amount of saline to replace the sampled blood. Perform automated pre-injection.Next, perform an automated intravenous injection of the drug clozapine N-oxide at an injection rate of 500 microliters per minute. Then perform post-injection blood sampling. Luteinizing hormone patterns in adult Kiss1-EYFP females that received a unilateral stereotaxic injection of AAV-hM3Dq-mCherry in the arcuate nucleus are presented.Diestrus luteinizing hormone levels are generally low, but variations are usually observed because of its pulsatile release. A sharp rise in luteinizing hormone levels occurs in response to clozapine N-oxide injection. Most mCherry neurons co-localized with Kiss1-EYFP demonstrated that the viral and neuronal activation is specific to the targeted population.A luteinizing hormone pulsatile pattern of release in diestrus wild-type mice, followed by the response to an IP injection of Kisspeptin-10, is shown. Clear luteinizing hormone pulses, typical for a female in diestrus, were observed, showing low basal luteinizing hormone levels. An immediate and robust increase in luteinizing hormone was detected in response to Kisspeptin administration.