نعترف ب Jiří Macas (مركز الأحياء CAS ، České Budějovice ، جمهورية التشيك) لتوفير سلالة البكتيريا الزراعية. تم الاعتراف بعلوم نباتات المرافق الأساسية في CEITEC MU لدعمها الفني. ودعمت هذا العمل وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية مع الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية - مشروع "SINGING PLANT" (رقم. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) والمشروع بين التكاليف LTC20004.

تحريض الجذور المشعرة بوساطة Agrobacterium وتجديدها في النباتات

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري دون أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

قمنا بتطوير بروتوكول بسيط لتحويل جذر الشعر والتجديد اللاحق في B. napus و A. thaliana. تتضمن هذه العملية تحريض جذر الشعر القائم على الحقن في hypocotyl (B. napus) أو جذع الإزهار الأولي (A. thaliana). كانت طريقة حقن hypocotyl مع سلالة البكتيريا الزراعية C58C1 التي تحمل بلازميد Ri فعالة أيضا في عائلة Fabaceae10,11 ، إلى جانب أعضاء Brassicaceae المقدمة في هذه الدراسة.
بديل للطريقة القائمة على الحقن هو التحول القائم على الغمر الذي يتكون من غمر النبات في تعليق بكتيري ، يليه الزراعة المشتركة للزرع مع البكتيريا الزراعية. تتمثل ميزة الطريقة القائمة على الحقن على طريقة الغمر في الوقت الذي يتم توفيره بسبب عدم وجود بعض خطوات البروتوكول: تحضير الزرع ، واختبار وقت الزراعة المشتركة ، والثقافة على وسط يحتوي على هرمون لتحريض الجذور المشعرة. على الرغم من أن كلا النهجين فعالان في تحريض جذر الشعر ، فقد لوحظت كفاءة تحويل أعلى في بعض الأنواع بالطريقة القائمة على الحقن مقارنة بغمر النبات12,13. علاوة على ذلك ، فإن التحول القائم على الحقن مفيد أيضا لتوليد النباتات المركبة (جذور الشعر المعدلة وراثيا والبراعم البرية). بعد قطع الجذور الأصلية للنبات المحول ، تدعم الجذور المشعرة نمو النبات ، ويمكن دراسة جين التحوير في سياق النبات بأكمله.
الخطوة الحاسمة لتحريض جذر الشعر هي حقن اللقاح في hypocotyl ، أو جذع الإزهار الأولي. إن hypocotyls من B. napus قابلة للكسر ، ويمكن أن يحدث قطع hypocotyl كله بسهولة. يمكن ملاحظة الشيء نفسه مع A. thaliana بسبب نحافة جذع الإزهار. إذا كانت هناك حاجة إلى مقارنة كفاءة التحول بين الأنواع / الأصناف المختلفة ، فإننا نوصي بأن يقوم شخص واحد بإجراء جميع التجارب لتجنب الخطأ الناجم عن التلاعب والمهارة في حقن النباتات.
قمنا بتطوير بروتوكول فعال لتجديد جذور الشعر في B. napus DH12075 و A. thaliana Col-0. نظرا لأن التجديد عملية متغيرة للغاية ، فقد يتم تطبيق بعض تعديلات البروتوكول على نوع أو صنف من اختياره. على سبيل المثال ، يمكن استنباط البراعم المشتقة من الجذور المشعرة بنسبة أوكسين / سيتوكينين مختلفة (1: 1) في B. oleracea14. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام السيتوكينين ثيديازورون بدلا من BAP ، كما هو الحال في جذور B. campestris المشعرة15.
تمثل عمليات الإدراج المتعددة ل Ri plasmid T-DNA في جينوم النبات قيودا محتملة على نظام تحويل وتجديد جذر الشعر. في مثل هذه الحالات ، لا يتم الكشف عن أي نباتات خالية من TL / TR من بلازميد Ri بعد تحليل فصل شتلات T1. وبالتالي ، نوصي بتوليد العديد من خطوط الجذر المشعرة المستقلة لكل جين محور.
تعتبر مزارع الجذور المشعرة أداة قوية للغاية للدراسات الوظيفية الجينية ويرجع ذلك أساسا إلى إنشائها السريع وصيانتها الرخيصة (لا حاجة للهرمونات في وسائط الزراعة). يغطي هذا البروتوكول طرق تحريض الجذور المشعرة وتجديدها في B. napus و A. thaliana ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الجينات المحورة ذات الأهمية مباشرة في مزارع الجذور المشعرة ، في سياق النبات بأكمله باستخدام النباتات المركبة ، أو بعد تجديد النباتات المحورة وراثيا.

تحول النبات هو عنق الزجاجة لأي دراسة وراثية في بيولوجيا النبات. تستخدم البكتيريا التي تنقلها التربة ، Agrobacterium tumefaciens، على نطاق واسع كوسيلة لتوصيل الجينات عن طريق غمس الأزهار أو زراعة الأنسجة لتوليد المحولات. A. tumefaciens يصيب النباتات في موقع الجرح ويسبب الأورام بسبب نقل ودمج T-DNA من البلازميد المسبب للورم (Ti) في جينوم النبات المضيف. تستخدم سلالات A. tumefaciens المهندسة مع بلازميد Ti المعدل بدون T-DNA من النوع البري وناقل ثنائي مع T-DNA الاصطناعي ومواقع الاستنساخ لإدخال جين مهم كنظام فعال لتحويل النبات1. ومع ذلك ، فإن العديد من الأنواع والمحاصيل النموذجية متمردة على غمس الأزهار أو تجديد النباتات في المختبر أو لديها دورات نمو طويلة ، مما يؤثر على كفاءة نظام التحول هذا.
تحفز جذور Agrobacterium الجذرية تكوين جذور عرضية ، أو جذور مشعرة ، في موقع الجرح بعد إصابة نبات مضيف. على غرار A. tumefaciens، تنقل A. rhizogenes الحمض النووي التائي من البلازميد المستحث للجذر (Ri) إلى جينوم النبات المضيف، مما يتسبب في تطور جذور الشعر المعدلة وراثيا. يتم التحكم في هذه العملية بشكل رئيسي عن طريق جينات الجذور المسرطنة (rol) 2,3. باستخدام سلالات زراعية تحمل كلا من بلازميد Ri وناقل ثنائي اصطناعي يشفر جينا مثيرا للاهتمام ، تم استخدام مزارع الجذور المشعرة لإنتاج بروتينات مؤتلفة ، أو تحليل وظيفة المروجين أو الجينات ، أو تحرير الجينوم باستخدام التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPRs) / البروتين المرتبط بكريسبر 9 (Cas9) 4،5،6.
يستخدم بروتوكولنا سلالة Ti-less A. tumefaciens C58C1 التي تحمل بلازميد Ri pRiA4b7. يتكون T-DNA لبلازميد Ri من منطقتين ، اليمين واليسار T-DNA (TR-DNA و TL-DNA ، على التوالي) ، والتي يمكن أن تندمج بشكل مستقل في جينوم النبات8. باستغلال هذا النظام ، تم تحسين عملية تحويل النبات المطولة في صنف Brassica napus DH120759. يسمح البروتوكول المفصل أدناه بتجديد خطوط جذر مشعرة مختارة والحصول على نباتات T1 تحمل جين التحوير ذي الأهمية وخالية من جينات rol في عام واحد تقريبا. يمكن استخدام تحويل جذر الشعر القائم على الحقن في أنواع الكرنبيات الأخرى ، كما هو موضح من خلال تحويل Arabidopsis thaliana Col-0. بينما يستخدم hypocotyl لتحويل B. napus ، يتم حقن A. thaliana في جذع الإزهار الأساسي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

يمثل تحويل الجذر المشعر أداة متعددة الاستخدامات للتكنولوجيا الحيوية النباتية في مختلف الأنواع. تؤدي العدوى بسلالة Agrobacterium التي تحمل بلازميد محفز للجذر (Ri) إلى تكوين جذور مشعرة في موقع الجرح بعد نقل T-DNA من بلازميد Ri إلى جينوم النبات. يصف البروتوكول بالتفصيل إجراء تحريض جذر الشعر القائم على الحقن في DH12075 براسيكا نابوس وأرابيدوبسيس ثاليانا كول-0. يمكن استخدام الجذور المشعرة لتحليل جين التحوير ذي الأهمية أو معالجتها لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. وسط التجديد الذي يحتوي على السيتوكينين 6-بنزيلامينوبورين (5 مجم / لتر) والأوكسين 1-حمض النفثالين الخليك (8 مجم / لتر) يستحث بنجاح تكوين البراعم في كلا النوعين. يغطي البروتوكول التنميط الجيني واختيار المجديدات ونباتات T1 للحصول على نباتات تحمل جينا محورا مهما وخالية من الحمض النووي التائي من بلازميد Ri . كما تم تصوير عملية بديلة تؤدي إلى تكوين نبات مركب. في هذه الحالة ، يتم الاحتفاظ بالجذور المشعرة على اللقطة (بدلا من الجذور الطبيعية) ، مما يتيح دراسة جين التحوير في ثقافات الجذور المشعرة في سياق النبات بأكمله.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين بروتوكولات التحول المستندة إلى الجذر المشعر لتعزيز الكفاءة في الكرنب

تحول الجذور المشعرة وتجديدها في أرابيدوبسيس ثاليانا وبراسيكا نابوس

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

لقد قمنا سابقا بتحسين بروتوكول لتحريض جذور الشعر القائم على الحقن في ثلاثة أصناف من براسيكا نابوس ، وهي DH12075 و Topas DH4079 و Westar9. لتطبيق بروتوكول التحول هذا على النوع النموذجي A. thaliana ، تم حقن سيقان الإزهار الأولية للنباتات البالغة من العمر 1 شهرا بلقاح زراعي. ظهرت جذور الشعر في موقع الحقن بعد 2-4 أسابيع. تم استئصال الجذور المشعرة وزراعتها على الوسط الصلب. يوضح الشكل 1 مقارنة الطريقة في هذين النوعين.
تم نقل خطوط جذر مشعرة مختارة إلى وسط التجديد للحث على تكوين الساق. في A. thaliana ، تم تحفيز كالي أصفر في غضون 14 يوما في جميع خطوط الجذر المشعرة العشرة التي تم اختبارها. ظهرت أول لقطة أولية مرئية كبقع خضراء داكنة في غضون 3 أسابيع بعد نقلها إلى وسط التجديد (الشكل 2). بعد 4 أسابيع من الثقافة ، غطت البراعم الجذور المشعرة في 9 من 10 خطوط جذر مشعرة (كفاءة تجديد 90٪). في بعض الحالات ، تم استنباط الجذور المغامرة من الكالس (الشكل 2H). لم يتجدد خط واحد حتى بعد 3 أشهر على وسط التجديد (كل 4 أسابيع ، تم نقل جذور الشعر إلى وسط جديد). وبالتالي ، فإن كفاءة تجديد جذور A. thaliana المشعرة تشبه كفاءة B. napus DH12075 9.
تعرض مجددات الجذور المشعرة ل B. napus و A. thaliana نمطا ظاهريا قزما (الشكل 3) ، وهي سمة نموذجية للنباتات المشتقة من الجذورالمشعرة 2. لاحظنا أيضا أنظمة الجذر الكثيفة والأوراق المجعدة والتغيرات في وقت الإزهار. هذا النمط الظاهري المزعوم للجذر المشعر (أو Ri) ناتج عن جينات rol من بلازميد Ri التي يتم إدخالها في جينوم النبات. قد يكون إدخال Ri T-DNA وجين التحوير المشفر على ناقل ثنائي مستقلا أو مرتبطا. وبالتالي ، فإن تحليل الفصل لذرية T1 الناتجة عن التلقيح الذاتي يساعد على تحديد النباتات الخالية من الرول التي تعبر عن الجينات المحورة محل الاهتمام. يتم إجراء التنميط الجيني لنباتات T1 بواسطة بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة ب ORFs من TL و TR والجينات المحورة ذات الأهمية. يتم التحقق من عدم وجود تلوث زراعي من خلال عدم وجود منتجات PCR من الاشعال virC (الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> الشكل 1: ملخص الإجراء في A. thaliana و B. napus. يؤدي حقن لقاح Agrobacterium في جذع hypocotyl أو الإزهار الأولي إلى تطور جذور الشعر. يمكن أن تحل الجذور المشعرة محل الجذور الأصلية لتوليد نبات مركب سيتم تنميطه وراثيا وتحليله (الأسهم الزرقاء). يمكن تجديد الجذور المشعرة المستزرعة إلى نباتات T0 ، ونشرها في نباتات T1 ، والنمط الوراثي (الأسهم الخضراء). يمكن أيضا زراعة الجذور المشعرة للتحليل الوظيفي (السهم الأسود). يتم تقديم أمثلة على نتائج التنميط الجيني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> الشكل 2: تجديد الجذور المشعرة في A. thaliana. (أ) ثقافة الجذر المشعر 1 يوم بعد نقله إلى اللوحات. (ب، ج) وضعت كالي في غضون 2 أسابيع من الثقافة على وسط التجديد. (د، ه) ظهرت تبادل لاطلاق النار primordia بعد 3 أسابيع من الثقافة. (ز ، ح) تتشكل البراعم بعد 4 أسابيع. (ح) الجذور العرضية التي تطورت من الكالس. (ج، و، ط) خط جذر شعر غير متجدد. تمثل قضبان المقياس 1 سم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> الشكل 3: صور تمثيلية لنباتات B. napus و A. thaliana البرية ومواد التجديد المشتقة من الجذور المشعرة (نباتات T0). لاحظ النمط الظاهري Ri للمجددات. تمثل قضبان المقياس 2 سم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus at JoVE.com

يصف البروتوكول تحريض جذر الشعر باستخدام سيقان الإزهار الأولية Arabidopsis و Brassica napus hypocotyls. يمكن استزراع الجذور المشعرة واستخدامها كنباتات لتجديد النباتات المعدلة وراثيا.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

يهدف بحثنا إلى تطوير بروتوكول للتحول الفعال في Brassicaceae. باستخدام التحول القائم على جذور الشعر ، قمنا بتحسين كفاءة التحول بشكل كبير في Brassica napus ، وهو أمر بالغ الأهمية لبحثنا. اختبرنا أيضا البروتوكول في الأنواع النموذجية Arabidopsis thaliana.لقد قمنا بتحسين بروتوكول أصناف الربيع DH12075 في براسيكا نابوس. التحدي التالي هو تحسين بروتوكول تحويل وتجديد الأصناف الشتوية في براسيكا نابوس ، وكذلك لبراسيكا رابا وبراسيكا أوليراسيا. يمكن نشر الجذور المشعرة بسهولة ، ويتيح نموها السريع التحليل الفوري للجين محل الاهتمام بعد فترة وجيزة من التحول.وبالتالي ، يصبح من الممكن تجديد خطوط جذر مشعرة محددة بشكل انتقائي تظهر السمة المطلوبة. على سبيل المثال ، طفرة جينية أدخلتها كريسبر-كاس.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.1K Views.  Masaryk University. يهدف بحثنا إلى تطوير بروتوكول للتحول الفعال في Brassicaceae. باستخدام التحول القائم على جذور الشعر ، قمنا بتحسين كفاءة التحول بشكل كبير في Brassica napus ، وهو أمر بالغ الأهمية لبحثنا. اختبرنا أيضا البروتوكول في الأنواع النموذجية Arabidopsis thaliana.لقد قمنا بتحسين بروتوكول أصناف الربيع DH1...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحسين بروتوكولات التحول المستندة إلى الجذر المشعر لتعزيز الكفاءة في الكرنب

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

تحويل جذر الشعر بوساطة Agrobacterium في DH12075 براسيكا نابوس

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

طرق التجديد والاختيار لمجددات DH12075 براسيكا نابوس ونباتات T1

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.