هي ملفقة القنوات ميكروفلويديك في دوري البولي (Zeonex ® 690R ، Zeon الكيميائية المحدودة ، لويزفيل ، كنتاكي). Zeonex لديه درجة حرارة التحول الزجاجي (T ز) من 136 درجة مئوية ، والأشعة فوق البنفسجية شفافة ، وهو أمر ضروري للكيمياء الخفيفة الموجهة المستخدمة في تشكيل متراصة التي يسهل اختراقها. هي ملفقة من قبل microchannels الدقيقة النقش الساخنة مع قالب رئيسية كهربي نيكو ، التي لديها سلبية (معكوس) ملامح منصة ميكروفلويديك. ويتم ذلك في النقش على الساخن على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع القالب والركيزة البوليمر بين اثنين من المعادن platens موازية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسخين platens يصل إلى درجة حرارة النقش (166 درجة مئوية) ، والتي هي 30 درجة مئوية فوق جي تي من Zeonex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم ضغط platens معا لحوالي 5 دقائق والمحافظة على ضغط 250 رطل في البوصة المربعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة العفن والركيزة لمن platens ساخنة ، تترك لتبرد لمدة 1-2 دقيقة ، ثم فصلها عن بعضها البعض يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حفر الآبار من 1.5 ملم قطر في نهايات القنوات لإدخال العينة وجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم هو الركيزة البلاستيك تنقش المستعبدين حراريا مع قطعة أخرى من Zeonex لتشكيل قنوات ميكروفلويديك المغلقة. يمكن الركيزة تنقش وقطعة تغطي يكون للأشعة فوق البنفسجية أو الأوزون البلازما معاملة حرارية قبل الرابطة لتعزيز كفاءة وختم ضمان الدقة للهيكل قناة المغلقة (باتاشاريا وKlapperich ، 2007). </li></ol> تصنيع الصلب المرحلة العمود (SPE) استخراج داخل القنوات ميكروفلويديك البلاستيك تلفيق المرحلة الصلبة هي عملية من خطوتين. في البداية ، وmicrochannels ملفقة وتعديل السطح من أجل تحسين الالتصاق من العمود SPE إلى الجهاز من البلاستيك. بلمرة ضوئية المنشأ عبر ترقيع سطح يستخدم لfunctionalize أسوار microchannels البوليمرية. إجراء عمليات ترقيع على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتلئ microchannels بمزيج من diacrylate 01:01 الإيثيلين (EDA) وميتاكريليت الميثيل (MMA) مع benzophenone 3 ٪ ، وهو استخلاص الهيدروجين photoinitiator. يتم شراؤها ، وجمعية الإمارات للغوص ، ومجلس العمل المتحد benzophenone من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة ومن ثم المشع للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة في الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر و 200 ميغا جول / سم 2 للطاقة في صك التعرض الأشعة فوق البنفسجية (CL - 1000 Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية ، UPV شركة ، المرتفعات ، كاليفورنيا). ويحدث عن طريق تطعيم H - التجريد البلمرة والنتائج في سلاسل البوليمر سطح المربوطة ، والتي أدرجت ضمن الحصول على خليط البلمرة تستخدم لإعداد متراصة في الخطوة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة مونومر الزائدة من القنوات التي الشطف مع 15 ميكرولتر من الميثانول باستخدام الشفط. </li></ol> بعد عملية photografting ، يتم تشكيل البوليمر microporous متراصة داخل microchannels أن إيقاع جسيمات السيليكا لاستخراج الحمض النووي. مستعدة متراصة مسامية في الموقع على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتلئ القنوات السطحية تعديل بمزيج السلائف متراصة مؤلفة من فاعل (15 ٪ بالوزن) ، ادما (10 ٪ بالوزن) ، 1 - dodecanol (52.5 ٪ بالوزن) ، سيكلوهيكسانول (22.5 ٪ بالوزن) ، DMPAP (1 ٪ بالوزن مع الاحترام لمونومرات) ، و 0.7 ميكرومتر جسيمات السيليكا (15 ٪ بالنسبة لإجمالي حجم الخليط قبل البوليمر). تم شراء المجهرية من السيليكا Polysciences ، وشركة (وارينغتون ، والسلطة الفلسطينية) ويتم شراؤها من مونومرات والمذيبات porogenic من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير المشع في الشريحة مع الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker فوق البنفسجية على 200 ميغا جول / سم 2 مقابل 1.1 دقيقة على بدء البلمرة ، ويتم إزالة مونومر الزائدة من القنوات التي الشطف مع 15 ميكرولتر من الميثانول باستخدام الشفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد ثم fluidic اتصالات (اتصالات NanoPorts TM ، أبتشيرتش العلمية ، اوك هاربور ، واشنطن) على مقدمة وآبار جمع من القنوات ميكروفلويديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم غسل متراصة مسامية مرة أخرى مع الميثانول لا يقل عن 30 دقيقة باستخدام مضخة الحقن بمعدل تدفق 100mL/hour. </li></ol> تلفيق CNT تحلل متراصة داخل القنوات ميكروفلويديك البلاستيك تلفيق للتحلل المركز الوطني للاستشعار متراصة (أنابيب الكربون) هي عملية من خطوتين. أولا ، يتم تعديل microchannels ملفقة السطحية (المطعمة) بالطريقة نفسها بالنسبة للأعمدة SPE في الجهاز من البلاستيك. بعد عملية photografting ، يتم تشكيل البوليمر microporous متراصة داخل متناهية التي يتم مشربة الأنابيب النانومترية الكربونية متعددة الجدران. مستعدة متراصة مسامية في الموقع على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعلق متعددة الجدران أنابيب في سيكلوهيكسانول بتركيز 2.27M. هذا هو ultrasonicated إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة في سعة 50 ٪ و 50 ٪ لدورة العمل مع خلية disruptor sonifier (Sonifier S - 250D ، المصنعة من قبل برانسون بالموجات فوق الصوتية ، دانبري ، ط م). قدمت صوتنة لتعليق فعال ومستقر من 0.5M تشارك المركز الوطني. تم شراء تشارك المركز الوطني من Nanolabs (برايتون ، MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتلئ القنوات السطحية تعديل بمزيج مماثلة السلائف متراصة إلا أنه الآن في حل سيكلوهيكسانول + يستخدم تشارك المركز الوطني. الخليط متراصة تتألف من فاعل (15 ٪ بالوزن) ، ادما (10 ٪ بالوزن) ، 1 - dodecanol (52.5 ٪ بالوزن) ، وتشارك المركز الوطني سيكلوهيكسانول + (22.5 ٪ بالوزن). لهذا الحل واضاف DMPAP photoinitiator (1.13 ٪ فيما يتعلق بالوزن مونومرات). يتم شراؤها من مونومرات والمذيبات وporogenic DMPAPA من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير المشع في الشريحة مع الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية في 2 ميغا جول / 120 سم عن 0،9 دقيقة لبدء البلمرة. هو انعكاس الجهاز 180 درجة في crossliker والمشع لآخر دقيقة في 120 ميغا جول 0.9 / سم 2. تتم إزالة مونومر الزائدة من القنوات التي الشطف مع 50 ميكرولتر من الميثانول باستخدام الشفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد ثم fluidic اتصالات (اتصالات NanoPorts TM ، أبتشيرتش العلمية ، اوك هاربور ، واشنطن) على مقدمة وآبار جمع من القنوات ميكروفلويديك. </li></ol> البكتيرية إعداد نموذج للاستخدام مع المركز الوطني للاستشعار تحلل متراصة إعداد نموذج لعينة جرثومية ينطوي على اتخاذ قياس الكثافة البصرية في ل 600Nm للتأكد من أن العينة ليست مركزة للغاية وذلك لتفادي انسداد القناة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ القراءة في التطوير التنظيمي ل 600Nm مع البكتيريا في وسائل الإعلام ، ويتم ذلك مع مقياس التكيف للظلام (إيبندورف مقياس التكيف للظلام ، إيبندورف العلمية المحدودة ، ويستبري ، نيويورك). تمييع العينة حتى قراءات OD تقع ضمن نطاق 0،18-0،25 A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة في جهاز الطرد المركزي 6500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وسكب وطاف. </li></ol> تحلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البكتيريا Resuspend في GuSCN * + 0.01 ٪ + 4 ٪ SDS بروتيناز K (0.8mg/ml). دوامة لفترة وجيزة (1ml من البكتيريا في وسائل الإعلام ينبغي أن يكون معلق في GuSCN 1ml). وأضيف بروتين كاف في حل للمساعدة في تغيير طبيعة البروتينات التي تعلق على الحمض النووي البكتيرية ويمنع DNAases وRNAases. فائدة إضافية للبروتين K هو أنه يساعد أيضا مع تحطيم البروتينات الخلوية الجدار الذي أمر مرغوب فيه لأن كلا من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام جدران الخلايا البكتيريا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين (على الرغم من الجراثيم سلبية الغرام وعادة ما يكون المزيد من البروتين ). وبالإضافة إلى المساعدات chaotropic العازلة للبروتين كاف مع تغيير طبيعة البروتينات في حين أن المنظفات يعطل جدار الخلية. اشتريت بروتين كاف وثيوسيانات guanidinium (GuSCN) من شركة Qiagen (فالنسيا ، كاليفورنيا). تم شراؤها SDS (كبريتات الصوديوم دوديسيل) من بيرس (روكفورد ، إلينوي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل فورا العينة في حقنة متصلة أنابيب PEEK. نضح المحقنة بحيث لا الهواء في النظام. توصيل أنابيب للnanoport والقناة. </li></ol> تم استخدام مضخة الحقن KDS100 (المصنعة من قبل العلم دينار كويتي ، Holliston ، MA) لتجارب ومعدل تدفق المستخدمة هي 450 ميكرولتر / ساعة لكافة الخطوات. تدفق القناة تحلل العينات في 450ul/hr. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العينة ، والشروع في استخراج الحمض النووي عن طريق جمعية مهندسي البترول (انظر استخراج الحمض النووي البروتوكول). ملاحظة : هذه عينة جرثومية لن تحتاج لمتابعة تحميل الخطوة 2 ، حيث يتم تعليق GuSCN *. </li></ol> استخراج الحمض النووي البروتوكول إجراءات استخراج تتكون من 3 خطوات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بواشنطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل. </li></ol> تم استخدام مضخة KDS100 حقنة (المصنعة من قبل العلم دينار كويتي ، Holliston ، MA) لتجارب ومعدل التدفق كان يستخدم 300 ميكرولتر / ساعة لكافة الخطوات. حمولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالة القناة مع العازلة chaotropic (GuSCN * ، guanidinium ثيوسيانات) لمدة 1-2 دقيقة قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج العينة مع العازلة chaotropic في نسبة 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق خليط عينة عن طريق القناة لمدة 3 دقائق. </li></ol> غسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل القناة مع الإيثانول 70 ٪ لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل القناة مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 2 دقيقة. </li></ol> أزل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الحمض النووي المستخرج من المياه لمدة 3 دقائق ميليبور. جمع 15 ميكرولتر من المنقى ، PCR جاهزة الحمض النووي. </li></ol> * تم استخدام GuSCN من عدة Qiagen (الاحتياطي RLT).

<ol>
	<li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+chemical+analysis+of+plasma+and+ultraviolet-ozone+surface+treatments+for+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices.">Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7, 876-882 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

fabrication of the thermoplastic microfluidic channels

في المختبر ، وقد نجحنا في عزل الأحماض النووية مباشرة من وحدات التخزين وميكروليتر submicroliter الإنسان البول والدم والبراز باستخدام البوليمر / جسيمات متناهية الصغر تحلل الميكروسكيل المركبة واستخراج الأعمدة الصلبة المرحلة. عينات تعافى تتركز ، وعينات صغيرة الحجم التي PCRable ، من دون أي تنظيف إضافية. هنا ، ونحن لشرح كيفية تصنيع رقائق ميكروفلويديك بالحرارة باستخدام النقش الساخنة والختم الحرارة. ثم ، نحن لشرح كيفية استخدام السطح في ضوء توجه ترقيع الوضع الطبيعي والبلمرة من خلال رقاقة مختومة لتشكيل مركب الأعمدة المرحلة الصلبة. نظهر ترقيع والبلمرة عمود أنابيب / مركب البوليمر الكربون لتحلل الخلايا البكتيرية. ثم نعرض عملية تحلل تليها مرحلة الاستخراج صلبة من الأحماض النووية من العينة على الشريحة باستخدام السيليكا / عمود مركب البوليمر. البروتوكولات المرفقة تحتوي على تعليمات مفصلة حول كيفية جعل كل من تحلل والأعمدة الصلبة استخراج المرحلة.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels at JoVE.com

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

نحن هنا لشرح كيفية صنع رقائق ميكروفلويديك بالحرارة باستخدام النقش الساخنة والختم الحرارة. ثم نحن لشرح كيفية استخدام السطح في ضوء توجه ترقيع الوضع الطبيعي والبلمرة من خلال رقاقة مختومة لتشكيل مركب الأعمدة المرحلة الصلبة.

تلفيق القنوات ميكروفلويديك الحراري

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

fabrication-of-the-thermoplastic-microfluidic-channels

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Boston University. نحن هنا لشرح كيفية صنع رقائق ميكروفلويديك بالحرارة باستخدام النقش الساخنة والختم الحرارة. ثم نحن لشرح كيفية استخدام السطح في ضوء توجه ترقيع الوضع الطبيعي والبلمرة من خلال رقاقة مختومة لتشكيل مركب الأعمدة المرحلة الصلبة.

Video: Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

غير البلازما من الربط PDMS للصناعات رخيصة من أجهزة ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

ميكروفلويديك طلبات للحصول على تشخيص احدة

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Fabrication of Amperometric Electrodes

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements.  Here, we describe the techniques needed to generate low noise (&lt;0.5 pA) electrodes.  The techniques have been modified from published descriptions by previous researchers (1,2).  Electrodes are made by preparing carbon fibers and threading them individually into each capillary tube by using a vacuum with a filter to aspirate the fiber.  Next, the capillary tube with fiber is pulled by an electrode puller, creating two halves, each with a fine-pointed tip.  The electrodes are dipped in hot, liquid epoxy mixed with hardener to create an epoxy-glass seal.  Lastly, the electrodes are placed in an oven to cure the epoxy.  Careful handling of the electrodes is critical to ensure that they are made consistently and without damage.  This protocol shows how to fabricate and cut amperometric electrodes for recording from single cells.

This protocol describes how to generate carbon fiber electrodes. The electrodes are subsequently used to detect catecholamine release from vesicles with carbon fiber amperometry.

تصنيع أقطاب Amperometric

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements.  Here, we ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

تلفيق عضلي يبني الأنسجة المهندسة

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

ودقق ميكروفلويديك : تشغيل واستخدام لتصنيع السطحي المترجمة

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...