دعمت منحة SNSF 310030_219210 إلى J.H.N. نشر هذه المخطوطة دون قيود. تم إنشاء الشكل 1 بمساعدة BioRender.com.

تمت الموافقة على الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في شمال غرب ووسط سويسرا (EKNZ; معرف المشروع 2019-00273). قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام التجريبي للخزعات قبل الفحص بالمنظار. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. عزل الخلايا لعضويات المريء المشتقة من المريض
ملاحظة: ترد في الجدول 1 قائمة بالمكونات المتوسطة لزراعة عضويات المريء البشري.
<ol><li>الحصول على الخزعات. ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم الحصول على خزعتين من جزء واحد من المريء أثناء تنظير المريء والمعدة والاثني عشر باستخدام ملقط خزعة باستخدام منظار المعدة مع قناة عمل 2.8 مم.</li>
	<li>نقل الخزعات إلى وسط خال من الخلايا الكيراتينية المتاحة تجاريا (KSFM; الكالسيوم2+ 0.09 ملليمتر ، 1 نانوغرام / مل EGF ، 50 ميكروغرام / مل BPE). ملاحظة: يمكن تخزين الخزعات على الثلج لعدة ساعات حتى الاستخدام.</li>
	<li>استبدل وسط KSFM ب 1 مل من Dispase I (10 U / mL) واحتضان الخزعات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الخزعات في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.</li>
	<li>نضح Dispase باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر دون لمس الخزعات وحبيبات حطام الخلية.</li>
	<li>اشطف الخزعات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) سعة 1 مل من Dulbecco.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الخزعات في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.</li>
	<li>نضح المادة الطافية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.</li>
	<li>احتضان الخزعات ب 500 ميكرولتر من Trypsin-EDTA (0.05٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أثناء رجها عند 800 دورة في الدقيقة.</li>
	<li>قم بإجراء تعطيل ميكانيكي عن طريق السحب المتكرر لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق أحادي الخلية.</li>
	<li>قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر باستخدام رأس المكبس المطاطي لحقنة السل.</li>
	<li>اغسل المصفاة ب 2-4 مل من مثبطات تربسين فول الصويا (250 ميكروغرام / مل).</li>
	<li>قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 35 ميكرومتر مع غطاء إضافي على أنبوب بوليسترين مستدير القاع سعة 5 مل.</li>
	<li>انقل المحلول أحادي الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>نضح المادة الطافية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.</li>
	<li>أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط KSFM.</li>
	<li>امزج 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.</li>
	<li>عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي.</li>
</ol>2. ثقافة العضوية المشتقة من المريض
<ol><li>أضف 1-2 مل من KSFM إلى تعليق الخلية بعد العد.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>نضح الطافع مع ماصة 1000 ميكرولتر دون إزعاج بيليه الخلية.</li>
	<li>أعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة هيدروجيل مستخلص الغشاء القاعدي (BME) (40 ميكرولتر من BME لكل 20000 خلية). ملاحظة: بعد إضافة BME ، احتفظ بالخلايا على الجليد لمنع التصلب المبكر ل BME.</li>
	<li>اقطع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط خليط تعليق خلايا BME اللزج.</li>
	<li>قم بتكوين قطرات 40 ميكرولتر في لوحة زراعة الخلايا المعلقة الدافئة مسبقا (37 درجة مئوية).</li>
	<li>احتضان اللوحة بدون وسط لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لضمان تصلب قطرات BME.</li>
	<li>أضف وسط KSFM-C الذي تم تسخينه مسبقا مع 10 ميكرومتر من Y27632 (مثبط ROCK) لأول يومين من الثقافة.</li>
	<li>استبدل الوسيط بوسيط KSFM-C جديد (بدون Y27632 و +/- سيتوكين مهم) كل يوم.</li>
	<li>قم بنضح الوسط وخدش القطرات باستخدام طرف الماصة مع إضافة 1 مل من Dispase II (1.5 وحدة / مل) باستمرار إلى البئر.</li>
	<li>انقل خليط BME-dispase إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مهتز لهضم BME.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ونضح Dispase II.</li>
	<li>تابع وفقا لبروتوكول قراءات الفائدة (على سبيل المثال ، عزل الحمض النووي الريبي أو عزل البروتين أو التثبيت بنسبة 4٪ PFA للأنسجة).</li>
</ol>3. عزل الخلايا لثقافات واجهة الهواء السائل المشتقة من المريض (ALI)
<ol><li>الحصول على الخزعات. أثناء تنظير المريء والمعدة والأمعاء باستخدام منظار المعدة مع قناة عمل 2.8 مم ، يتم أخذ خزعتين من جزء مريء واحد مع ملقط خزعة.</li>
	<li>ضع الخزعات في وسط خال من مصل الخلايا الكيراتينية متاح تجاريا (KSFM; Ca2+ 0.09 mM، 1 ng/mL EGF، 50 μg/mL BPE) ويخزن على الثلج لعدة ساعات حتى الاستخدام.</li>
	<li>تبادل KSFM مع 1 مل من ديسباز (10 وحدة / مل). بعد ذلك ، احتضان الخزعات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الخزعات في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.</li>
	<li>قم بإزالة Dispase باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر دون لمس الخزعات وحبيبات حطام الخلية.</li>
	<li>اغسل الخزعات ب 1 مل من DPBS.</li>
	<li>في درجة حرارة الغرفة ، قم بتدوير الخزعات عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.</li>
	<li>نضح الطاف مع ماصة 1000 ميكرولتر.</li>
	<li>احتضان الخزعات في 500 ميكرولتر من Trypsin-EDTA (0.05٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واخلطها باستمرار عند 800 دورة في الدقيقة أثناء الحضانة.</li>
	<li>قم بتعطيل الخزعات ميكانيكيا باستخدام السحب المتكرر لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق أحادي الخلية.</li>
	<li>مرر الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر برأس مكبس مطاطي من حقنة السلين واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.</li>
	<li>اغسل المصفاة ب 2-4 مل من مثبطات التربسين لفول الصويا (250 ميكروغرام / مل) لإزالة الخلايا المتبقية من المصفاة.</li>
	<li>قم بتصفية الخلايا باستخدام غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر في أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل.</li>
	<li>نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 mL.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر.</li>
	<li>أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من وسط KSFM (Ca2+ 0.09 mM) ، بما في ذلك 10 μM Y27632.</li>
	<li>نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الخلايا T25.</li>
	<li>لتوسيع الخلايا الكيراتينية الأولية ، قم بزراعة الخلايا حتى التقاء 60٪ -80٪ لمدة 1 أسبوع تقريبا. ملاحظة: يشكل الممر (P) 0 تكتلات خلايا تشبه الجزيرة وليس طبقة أحادية. تشكل الخلايا الكيراتينية الأولية طبقة أحادية من P1 فصاعدا.</li>
	<li>المرور عند التقاء 60٪ -80٪ وإعادة زرع P1 في 2-3 T25 أو 1-2 T75 قوارير زراعة الخلايا.</li>
	<li>المرور P1 مرة أخرى عندما تشكل الخلايا الكيراتينية طبقة أحادية مع التقاء 60٪ -80٪.</li>
</ol>4. ثقافة واجهة الهواء السائل المشتقة من المريض (ALI)
<ol><li>بذرة الخلايا الكيراتينية الأولية P2 على إدخالات transwell لثقافة ALI. ملاحظة: زرع 400000 خلية في 12 بئرا (200000 خلية كيراتينية لكل 0.6 سم2) في 500 ميكرولتر من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 نانوغرام / مل EGF ، 50 ميكروغرام / مل BPE).<ol><li>بذر 150000 خلية في 24 بئر (155000 خلية كيراتينية لكل 0.5 سم2) في 100 ميكرولتر من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 نانوغرام / مل EGF ، 50 ميكروغرام / مل BPE).</li>
		<li>بدلا من ذلك ، قم بالتجميد في وسط KSFM (Ca2 + 0.09 mM + 10٪ DMSO) عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ثم انقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ملاحظة: عند استخدام قوارير مجمدة ، قم بالمرور مرة أخرى بعد الذوبان قبل استخدام الخلايا لثقافة ALI.</li>
	</ol></li>
	<li>أضف وسيطا إلى البئر السفلي أسفل إدخال لوحة الاستزراع transwell. ملاحظة: ل 12 لوحة بئر: 1.5 مل من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE). ل 24 لوحة بئر: 600 ميكرولتر من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE).</li>
	<li>استبدل الكالسيوم المتوسط إلى العالي KSFM (Ca2+ 1.8 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE) بعد يومين.</li>
	<li>قم بتغيير وسط KSFM عالي الكالسيوم كل يومين حتى اليوم 7.</li>
	<li>قم بإجراء الجسر الجوي في اليوم السابع عن طريق شفط الوسط من الغرفة العلوية واستبدال الوسط في الغرفة السفلية ب KSFM عالي الكالسيوم (Ca2+ 1.8 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE) يحتوي على 10 نانوغرام / مل KGF (= FGF7) ، 75 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك (AA).<ol><li>اختياري: أضف السيتوكين محل الاهتمام بالتركيز المطلوب إلى الوسط.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتغيير الوسيط كل يومين حتى اليوم 14.</li>
</ol>5. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)
<ol><li>تعقيم القطب الكهربائي لمقياس TEER عن طريق غمره في بئر من صفيحة 24 بئرا مع 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10-15 دقيقة.</li>
	<li>اغسل هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 5٪ عن طريق غمر القطب في 4 آبار فرعية مع ddH2O المعقم وترك القطب يجف في الهواء.</li>
	<li>اضبط الفراغ عن طريق وضع قطب كهربائي واحد في البئر والقطب الثاني في ملحق البئر ، وملئه ب PBS ، وقياس TEER. ملاحظة: الأحجام الموصى بها لقياسات TEER: ل 12 صفيحة بئر (1900 ميكرولتر في البئر و 900 ميكرولتر في الإدخال). ل 24 لوحة بئر (750-1000 ميكرولتر في البئر و 250 ميكرولتر في الإدخال).</li>
	<li>استبدل وسط ثقافات ALI ببرنامج تلفزيوني معقم بدرجة حرارة الغرفة. ملاحظة: قم بإزالة الوسط من البئر السفلي ، وفي خطوة ثانية ، من ملحق البئر. وبالمثل ، أضف PBS أولا إلى الإدخال ثم إلى البئر السفلي لمنع انفصال ثقافة ALI عن غشاء البئر.</li>
	<li>ضع أقطاب مقياس TEER في الآبار التجريبية مع مزارع ALI وقم بإجراء قياس TEER1. ملاحظة: قم بإجراء قياسات TEER كل يومين قبل تغيير الوسيط.</li>
</ol>6. التدفق الجزيئي
<ol><li>قم بتخفيف محلول مخزون FITC-Dextran (3-5 كيلو دالتون) إلى تركيز 1 مجم / مل عامل. ملاحظة: قم دائما بحماية FITC-Dextran من التعرض للضوء.</li>
	<li>قم بإعداد صف تخفيف مع انخفاض تركيز FITC (1000 ميكروغرام / مل إلى 0.25 ميكروغرام / مل) كمعيار للقراءة.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (1 مجم / مل) إلى الغرفة العلوية للترانسويل و 1.5 مل متوسط (+/- سيتوكين مهم) في الجزء السفلي وضع اللوحة في الحاضنة.</li>
	<li>اجمع 120 ميكرولتر من الوسط من المقصورة السفلية في النقاط الزمنية المعنية (على سبيل المثال ، 0 دقيقة ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة ، 60 دقيقة ، 90 دقيقة ، 120 دقيقة ، 150 دقيقة ، و 180 دقيقة).</li>
	<li>يتكرر ماصة (50 ميكرولتر / بئر) من كل نقطة زمنية في لوحة سفلية مسطحة شفافة سوداء 96 جيدا.</li>
	<li>قم بإثارة FITC-dextran عند 490 نانومتر وقراءة الانبعاث بطول موجي 520 نانومتر باستخدام قارئ لوحات.</li>
	<li>حساب كمية التدفق الجزيئي وفقا للمعيار.</li>
</ol>

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تسمح الإجراءات المقدمة بزراعة المواد العضوية المشتقة من المريض وثقافات ALI مع احتمالات عالية للنجاح. تم تكييف بروتوكول العضوي من أول بروتوكول منشور يبلغ عن توليد عضويات المريء البشري26 ومن بروتوكول32 المنشور مؤخرا. وصف شيريل وزملاؤه نموذج ALI22. تساعد ال...

يضر التهاب المريء بسلامة الحاجز الظهاري1،2،3،4،5 ، كما لوحظ في التهاب المريء اليوزيني (EoE) ، وهو مرض التهابي مزمن يهيمن عليه Th2 في المريء6. تم وصف EoE لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين7،8 ويتم تحريضه في الغالب بواسطة مستضدات الغذاء9،10،11،12،13. الأعراض الأكثر شيوعا ل EoE في السكان البالغين هي عسر البلع وانحشار الطعام14. في الأطفال ، يظهر EoE عادة مع الفشل في النمو ، ورفض الطعام ، والقيء ، وآلام البطن15. حددت دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) جينات خطر EoE المشاركة في سلامة الحاجز الظهاري ، مما أدى إلى نقل الظهارة إلى بؤرة أبحاث EoE16،17،18. كشفت EoE transcriptomics كذلك أن عملية التمايز الضعيفة وتضخم المنطقة القاعدية التفاعلية يتسببان في وظيفة الحاجز للخطر لظهارة المريء3،5،19،20،21،22. أدى الفهم المبكر لكون EoE مرضا بوساطة Th26 إلى اكتشاف IL-13 كوسيط قيادة عن طريق الإخلال بسلامة الظهارة3،4،21،23. توفر الأنظمة التجريبية التي تسمح بتشريح التأثيرات بوساطة السيتوكين على السلامة الظهارية من ضعف الحاجز الداخلي من خلال الاستعداد الوراثي إمكانية دراسة التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والظهارة في EoE. تم اقتراح عضويات المريء البشرية ومزارع واجهة الهواء السائل (ALI) كأدوات قيمة لتحليل عواقب تحفيز السيتوكين على سلامة الظهارة5.
تم إنشاء البروتوكول الأول لتوليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة البالغة (ASC) بعد خمس سنوات من التقارير المنشورة الأولى عن العضويات المعوية في عام 2009 باستخدام Lgr5 + ASCs المعوية التي تلخص المقصورة الظهارية للأمعاءالدقيقة 24. كان DeWard et al. رائدا في توليد المواد العضوية من الخلايا الظهارية المريئيةللفئران 25. في عام 2018 ، قام Kasagi et al. بتوليد عضويات المريء البشري من خط خلايا ظهارة المريء الحرشفية البشرية الخالدة EPC2-hTERT والخلايا الأولية المشتقة من المريض26. في نفس العام ، نجح Zhang et al. في توليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). لقد حددوا أهمية تثبيط TGFβ والبروتين المورفولوجي العظمي (BMP) لتطوير الخلايا السلفية المريئية (EPC) والدور الحاسم لإشارات Notch في تمايز الظهارة الحرشفية الطبقية26,27. استكمل تريسنو وزملاؤه هذه النتائج من خلال تحديد Sox2 كمثبط Wnt يوجه مصير النمو نحو تمايز المريء28. أدت التحسينات اللاحقة للبروتوكولات والتركيب المتوسط وظروف الاستزراع إلى زيادة معدل تكوين الأعضاء وجعلت الاستزراع الفرعي واستعادة المواد العضوية بعد الحفظ بالتبريد ممكنا26،29،30،31،32. على الرغم من أن هذه الكائنات العضوية هي أدوات قوية لدراسة بنية الأنسجة والتعبير عن الجينات المستهدفة المحتملة بعد التحفيز بالسيتوكينات ، إلا أن عضويات المريء لن توفر إمكانية قياس المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو تدفق الجزيئات الكبيرة كمقاييس مباشرة لسلامة الحاجز. كما وصفه شيريل وزملاؤهسابقا 22 ، تسمح ثقافات ALI التي تنمذجة التمايز الظهاري4 بإجراء تقييمات مباشرة للسلامة الظهارية. يعد الجمع بين المواد العضوية المشتقة من المريض ومزارع ALI أداة قوية للتحقيق في بنية الأنسجة وسلامة الحاجز الظهاري في EoE.
فيما يلي إجراءات مع تعليمات لعزل الخلايا القابلة للحياة من خزعات المريء وإنشاء مزارع عضوية المريء و ALI التي يمكن استخدامها بشكل أكبر لدراسة آثار السيتوكينات على سلامة الحاجز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

تتعرض ظهارة المريء الحرشفية مباشرة للبيئة ، وتواجه باستمرار المستضدات الأجنبية ، بما في ذلك مستضدات الطعام والميكروبات. يعد الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري أمرا بالغ الأهمية للوقاية من العدوى وتجنب الالتهاب الناجم عن المستضدات المشتقة من الغذاء غير الضارة. توفر هذه المقالة بروتوكولات مبسطة لتوليد عضويات المريء البشرية وثقافات واجهة الهواء السائل من خزعات المريض لدراسة المقصورة الظهارية للمريء في سياق توازن الأنسجة والمرض. كانت هذه البروتوكولات معالم علمية مهمة في العقد الماضي ، حيث وصفت الهياكل الشبيهة بالأعضاء ثلاثية الأبعاد من الخلايا الأولية المشتقة من المريض ، والمواد العضوية ، وثقافات واجهة الهواء والسائل. إنها توفر إمكانية التحقيق في وظيفة السيتوكينات المحددة وعوامل النمو ومسارات الإشارات في ظهارة المريء في إطار ثلاثي الأبعاد مع الحفاظ على الخصائص الظاهرية والجينية للمتبرع. توفر المواد العضوية معلومات عن العمارة المجهرية للأنسجة من خلال تقييم النسخ والبروتين بعد تحفيز السيتوكين. في المقابل ، تسمح ثقافات واجهة الهواء السائل بتقييم سلامة الحاجز الظهاري من خلال المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو قياسات تدفق الجزيئات. يعد الجمع بين هذه الكائنات العضوية وثقافات واجهة الهواء السائل أداة قوية لتطوير البحث في ظروف الحاجز الظهاري المريئي الضعيف.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الحاجز الظهاري في التهاب المريء اليوزيني 

ستنمو عضويات المريء من الخلايا الأولية المستخرجة من خزعات المريض وفقا لتعليمات البروتوكول المقدم ، كما هو موثق باستخدام مجهر برايت فيلد المقلوب (الشكل 1). تبدأ ASCs الظهارية في تكوين مجموعات الخلايا بطريقة ذاتية التنظيم خلال اليومين الأولين من الثقافة بعد بذر الخلايا المعز?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

هنا ، يتم توفير بروتوكول لثقافة عضويات المريء البشري وثقافة واجهة الهواء السائل. يمكن استخدام ثقافة واجهة الهواء السائل لعضويات المريء لدراسة تأثير السيتوكينات على الحاجز الظهاري المريئي.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

نحن نحقق في الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المريء اليوزيني ونحاول كشف الشلال الالتهابي الذي يحفز ويعزز العملية الالتهابية المزمنة ل EOE. تحديد وسطاء المناعة الجدد الذين يساهمون في التسبب في المرض يتمحور حول ضعف الحاجز الظهاري والموافقة على الأجسام المضادة العلاجية ضد الوسطاء المناعيين المذكورين. لقد حددنا السيتوكينات الفرعية IL-20 كوسطاء التهابيين يضعفون التمايز الظهاري والتقرن مما يؤدي إلى ضعف الحاجز الظهاري عبر مسار كيناز MAP.

three-dimensional-cell-culture-models-to-investigate-epithelial

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis 

Unit 1

Digestive System

SCIENTISTS IN ACTION

442 Views.  University of Basel. نحن نحقق في الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المريء اليوزيني ونحاول كشف الشلال الالتهابي الذي يحفز ويعزز العملية الالتهابية المزمنة ل EOE. تحديد وسطاء المناعة الجدد الذين يساهمون في التسبب في المرض يتمحور حول ضعف الحاجز الظهاري والموافقة على الأجسام المضادة العلاجية ضد الوسط...

Video: Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.