1. إعداد الدهون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ربط البروتينات إلى النشرة العلوي من طبقة ثنائية ، ونحن نستخدم ني 2 + الدهون مخلبية ، الذي ربط بروتينات المؤتلف مع بولي الحامض الاميني به. قد تلتزم بعض أنواع الخلايا غير خصيصا لطبقات ثنائية + المغلفة ني 2 ، ولكن الخلايا التائية عموما لا ، مما يجعل هذا الأسلوب الأمثل لتنشيط الخلايا T دراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحل عن طريق إعداد طبقة ثنائية الدهن حل ني 20 ٪ + 2 شيلاتينغ الدهون و 80 ٪ في فسفاتيديل كولين المبالغ المناسبة في انبوب من الزجاج مع 1-2 مل من الميثانول الكلوروفورم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتبخر المذيب تحت تيار من غاز النيتروجين في الدافئة (30-37 درجة مئوية) حمام الماء. هذه تستغرق عادة حوالي 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي المذيبات المتبقية تحت تفريغ عالية ، وذلك باستخدام lyophilizer لمدة 90 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الدهون في 2 ٪ - N - الأوكتيل غلوكوزيد المنظفات في تريس الملوحة العازلة ، مما يخلق حل المذيلات المنظفات / فسفوليبيد مختلطة. وينبغي تركيز فسفوليبيد النهائي سيكون 0.4 مم. لتشكيل الجسيمات الشحمية ، dialyze هذا الحل ، مقابل 3 تغييرات في تريس الملوحة لإزالة المنظفات وشكل الليبوزومات. ونحن نعمل مع وحدات التخزين عادة بناء على أمر من 1 مل مع قطرها 6 ملم سبكترا / بور أنابيب 2 # مع قطع حوالي 10 كيلو دالتون. نحن نحرص على استبعاد أي ليالي فقاعة الهواء عندما لقط الأنبوب. نحن عادة عقيمة ، تصفية هذا الحل وقيام غسيل الكلى في ظل ظروف نظيفة ، وكيفية التعامل معها باستخدام قفازات معقمة الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون هذا الحل واضح وضوح الشمس. يتم تخزينه تحت غاز الارجون لمنع الأكسدة. إذا عكر الحل ، ثم تولدت متعددة الجدران الحويصلات ، وسوف تحتاج إلى البدء من جديد. </li></ol> 2. تحديد مدى تودع ICAM - 1 و MHC على طبقة ثنائية مستو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إعداد التجربة ، فمن الضروري أولا لتحديد مقدار تودع ICAM - 1 و MHC على مساحة معينة من ني 2 طبقة ثنائية شيلاتينغ + عند تركيز معين من البروتينات القابلة للذوبان. للقيام بذلك ، طبقات ثنائية ودائع في 5 ميكرون الخرز الزجاجي القطر ، واحتضان والخرز الزجاجي مع حلول البروتين الذي التقريبية تلك الموجودة في الخلايا المستخدمة لتدفق التصوير ، وتلا كثافة البروتين ملزمة من قبل فحص تدفق immunofluorometric. بشروط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم الأجسام المضادة FITC المسمى مع الأرقام المعروفة في جزيء فلوريسئين الكشف عن البروتينات السطحية محدد. وتستخدم حبات فلوريسئين القياسية لمعايرة microfluorimeter التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف نقيم تلك الظروف التي تقريبية عن مستضد تقديم الخلايا مع 200 من molecules/μm2 ICAM - 1 و 0،2-20 molecules/μm2 من EK - I - 103 - MCC91 المعقدة. </li></ol> 3. تنظيف الزجاج لتغطية وزلات تشكيل طبقات ثنائية مستو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقات ثنائية شكل مستو بشكل عفوي عندما الليبوزومات الصمامات على الزجاج ، ولكن فقط إذا تم تنظيفها بشكل صحيح على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند العمل مع سمكة البيرانا ، ونحن ارتداء ملابس واقية كاملة ، بما في ذلك ساحة وحامض ، وحامض الثقيلة gauntlets مقاومة. فصل النفايات بعناية من النفايات العضوية والتخلص منها بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير محلول حمض سمكة البيرانا ، إضافة 75 مل من حمض الكبريتيك المركز إلى دورق جاف ، وإضافة بدقة 25 مل من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30 ٪. الحل تسخن بسرعة تصل إلى أكبر من 100 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر coverslips الجافة في حل لمدة 15 دقيقة. إزالته من الحل وشطف في تنقية المياه لمدة دقيقة على كل جانب. تجفيف coverslips باستخدام مصدر فراغ لتصريف المياه النقية. السماح للسمكة البيرانا حل لتبرد ، وإضافة إلى سمكة البيرانا حاوية النفايات ، والذي ترك مع غطاء فضفاض ، وضعت بشكل جيد في غطاء الدخان. عندما يتم إعداد جميع الليبوزومات ، coverslips ، والبروتينات ، والمشبك مناعية جاهزة للتشكيل. </li></ol> 4. تشكيل طبقات ثنائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشكل طبقات ثنائية ، مختبرنا يستخدم Bioptechs FCSII الدوائر ، التي لديها مزايا التدفئة متكاملة. نظام FCSII على قاعدة أن الفولاذ المقاوم للصدأ المشابك معا مشعب ميكروفلويديك مع طوقا 0.5 مم العلوي ، شريحة microaqueduct مغلفة أكسيد القصدير الإنديوم للتدفئة على سطح واحد ، مع الأخدود fluidic على الجانب الآخر ، وخالية من الغبار 0.25 ملم تنظيف طوقا الذي يحدد ارتفاع للغرفة وسمكة البيرانا تدفق ال 40 ملم على ساترة الجولة التي شكلت طبقة ثنائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين ينزلق الغطاء ، على أساسها يتم تشكيل طبقة ثنائية ، يجب أن يكون ماء للغاية ونظيفة ، والشريحة microacqueduct في الواقع يعمل على نحو أفضل لو كان أكثر مسعور. القرار هو تحقيق مزيد من مسعور microaqueduct عن طريق التعامل مع HSA 1 ٪ لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم غسل وتجفيف المياه النقية وتماما بعد تكييف هذه العملية ، وكذلك بين الاستخدامات. طلاء من التشويه والتحريف البروتينات التي خلفها هذا الإجراء يسمح 1 ميكرولتر من تعليق الحويصلية لتشكيل الجولة ، نصف الكرويةل قطرة هذا هو&gt; 0.25 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجميع خلية تدفق وشكل طبقات ثنائية مستو ، ضع متعددة ، مع أنابيب موجهة إلى أعلى ، على سطح مستو. ثم ، ضع 0. 5 طوقا ملم مع الثقوب وضعه فوق أنابيب fluidic ، والتأكد من أن يجلس عليه المسطحة. المكان برفق على الجانب microaqueduct وحشية مع القنوات fluidic مواجهة ، والتأكد من انها المقاعد المسطحة دون تطبيق أي ضغوط هبوطية ، حتى التحقق من أن الثقوب في الشريحة مع محاذاة أنابيب ميكروفلويديك. وضع خالية من الغبار طوقا 0.25 ملم مع قطع مستطيلة من على قمة الشريحة microaqueduct بحيث تصطف القناة مع قنوات fluidic وهناك مسافات كبيرة الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ما يصل إلى 5 × 1 ميكرولتر من قطرات الحويصلية التعليق على سطح الشريحة microaqueduct في نمط مثل هذه المسافة إلى مركز الوسط بين كل قطرة هو 2.5 ملم. قد تنخفض 5 الحويصلية لها تراكيب مختلفة ، ولكن في هذه الحالة سوف نقوم شكل طبقات ثنائية اثنين فقط ، واحدة مع عدم وجود ني 2 + + الدهون مخلبية واحد مع 10 ٪ نيكل + 2 + الدهون مخلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة هذه القطرات هي في مكان ، ومكان بعناية غطاء ينزلق لأسفل على السطح في اقتراح واحد. المشبك على القاعدة في أسرع وقت ممكن. ينبغي أن يسقط الحويصلية اجراء اتصالات مع انزلاق الغطاء. لا ينبغي أن يكون هذا الاتصال مكسورة ، منذ طبقات ثنائية ربما شكلت بالفعل ؛ أي اضطرابات قد تؤدي إلى طبقات ثنائية معيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم أن نتذكر أن علامة مواقف طبقات ثنائية مع بقع الحبر الصغيرة قليلة على الشريحة microacqueduct للمساعدة في تحديد المواقع ساترة على المجهر. الانتظار 20 دقيقة للتأكد من أن النظام قد معايرتها. نقل جميع الحلول باستخدام حقنة 20 مل متصلا إلى حوالي 20 سم من أنابيب مرنة ومحبس 3 الطريقة. توصيل منفذ آخر للمحبس إلى الخلية التدفق بطول قصيرة من الأنابيب لتقليل حجم القتلى بين محبس والخلية التدفق. ملء الحقنة مع HEPES - مخزنة المالحة التي تحتوي على 2 ملم MgCl 2 ، 1 ملم CaCl 2 ، 5 ملي الجلوكوز و 1 ٪ ألبومين المصل البشري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس الأنبوب ومحبس حتى لا تكون هناك فقاعات الهواء. ربط هذا إلى الخلايا ، ودفع التدفق من خلال 5 مل في اقتراح واحد بينما كان يشاهد للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء يمر عبر طبقة ثنائية. الآن ، سيكون لديك طبقات ثنائية الخاص. </li></ol> هذه المقالة الفيديو تدعم &quot;هنتر إلى المجمع وعودة : الوصلات العصبية والمناعية وKinapses تنويعات على موضوع للتنقل Amoeboid&quot; من قبل <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">مايكل لام داستن</a> ، <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">الاستعراض السنوي للخلية وعلم الأحياء التنموي</a> ، المجلد 24 ، 2008.

supported planar bilayers for the formation of study of immunological synapses and kinapse

طبقات ثنائية مستو المعتمدة هي أدوات قوية يمكن استخدامها في تصميم نموذج التفاعلات الجزيئية في المشبك المناعية. لمحاكاة التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية وخلايا مولدة عرض ، ونحن نستخدم Ni2 + - شيلاتينغ الدهون لترسيخ المؤتلف التصاق الخلايا والبروتينات MHC إلى النشرة العلوي من طبقة ثنائية مع بولي الحامض الاميني به. يتم إنشاء طبقات ثنائية مستو من خلال إعداد الدهون ، ومعالجة السطوح الزجاجية حيث ستشكل طبقة ثنائية ، وتشكيل طبقة ثنائية ثم في غرفة متخصصة تحتوي على تدفق الخلية حيث سيتم إضافة الخلايا الليمفاوية. وأضاف بعد ذلك ، واتهم طبقات ثنائية مع ني ونظيره الموسومة البروتينات المؤتلف. يمكن استخدامها أخيرا ، يتم حقن الخلايا الليمفاوية في الخلية وتدفق TIRF المجهري لتشكيل صورة المشبك والآليات التي تحكم تحرك الخلايا التائية ، ومواقع الفرز المستقبلة ، ومواقع للتدهور مستقبلات.

Watch this Scientific Journal Video about Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse at JoVE.com

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

طبقات ثنائية مستو المعتمدة هي أدوات قوية يمكن استخدامها في تصميم نموذج التفاعلات الجزيئية في المشبك المناعية. هنا ، وتبين لنا لترسيخ أساليب بروتينات التصاق الخلايا المعروفة لتعديل تشكيل المشبك إلى النشرة العلوي من bilyer الدهون ووضع تصور لتشكيل المشبك TIRF باستخدام المجهر.

مستو طبقات ثنائية لدعم تشكيل لدراسة نقاط الاشتباك العصبي والمناعي Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  New York University - NYU. طبقات ثنائية مستو المعتمدة هي أدوات قوية يمكن استخدامها في تصميم نموذج التفاعلات الجزيئية في المشبك المناعية. هنا ، وتبين لنا لترسيخ أساليب بروتينات التصاق الخلايا المعروفة لتعديل تشكيل المشبك إلى النشرة العلوي من bilyer الدهون ووضع تصور لتشكيل المشبك TIRF باستخدا...

Video: Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

التحقيق في آليات مناعية الكامنة وراء رفض زرع الأعضاء

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

إعداد طبقات ثنائية الاصطناعي للتجارب الكهربية

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

عالية الإنتاجية تحليل صورة الأجسام الشبه الكروية ورم: A برمجيات صديقة للمستخدم التطبيق لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا وبدقة

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...