والغرض من هذه الطريقة هو توليد المشبك المناعي الذي هو مثال على اقتران خلية إلى خلية التي شكلتها خلية مستضد تقديم والخلايا الليمفاوية T-مساعد. هدفنا هو تسجيل المراحل الأولى من تشكيل المشبك المناعي وتسجيل أحداث الاتجار التي تحدث في الخلايا اللمفاوية T-helper. هذه سوف تؤدي في نهاية المطاف إلى إفراز الاستقطاب في المشبك المناعي.
النهج المعروض هنا ينطوي على اقتران من خلية إلى خلية ، وحيازة الفاصل الزمني ، والمجهر الفلوري واسعة المجال ، ومعالجة الصور اللاحقة. وهذا يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصور، ويعزز الدقة الزمنية، ويسمح باقتناء عدة فلوروكرومات في متزامنة في المترافقات المشبكة المترافقة الناشئة ويقلل من تبييض الفلوريسنس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكول متوافق مع بروتوكولات تثبيت الخلايا نقطة النهاية التي من شأنها أن تسمح stains immunofluorescence وتحليلها.
هذا البروتوكول متوافق أيضا مع الليزر المسح الميكروسكوبية وغيرها من تقنيات المجهر للدولة من أحدث. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون آنا بيلو، طالبة الدراسات العليا، وأليخاندرو غاريدو، وهو فني، وصولانج مورينو، طالبة الدراسات العليا. لبدء هذا الإجراء، إضافة 150 ميكرولترات من الليفي إلى كل بئر من شريحة غرفة المايكروويل ثمانية واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
بعد فترة الحضانة، الاستنشاق فيبرومينيكتين وغسل كل جيدا مع 200 ميكرولترات من PVS لمدة دقيقتين مع اهتزاز لطيف. كرر هذا الغسيل مرة أخرى وترك غسل الثانية في البئر. نقل 10 ملليلتر من نقّال نقّال من خلايا راجي إلى أنبوب V-أسفل 15 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا و resuspend بلطف بيليه الخلية في الحارة, متوسطة كاملة بتركيز 1 مليون خلية لكل ملليلتر. لتسمية خلايا راجي، نقل العدد المطلوب من الخلايا في المتوسط الثقافة إلى أنبوب ملليلتر اثنين.
بالنسبة للشريحة الثمانية من الحجرة الصغيرة، هناك حاجة إلى ما مجموعه 1.6 ملليلتر من تعليق الخلية. إضافة خلية تعقب الأزرق إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومولار. Resuspend الخلايا الملطخة بتتبع الخلية الزرقاء ونقل 200 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من شرائح غرفة الليفية المغلفة.
احتضان الشريحة الغرفة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك، هز بلطف شرائح الغرفة على المجهر لضمان الالتزام بالخلايا راجي. غسل كل بعناية مع دافئة، خلية كاملة ثقافة المتوسطة للقضاء على خلية زائدة تعقب الأزرق.
تأكد من أن يتم الالتزام خلايا راجي إلى الجزء السفلي من لوحات، وأنها تظهر الثغرات بين بعضها البعض وأنها ليست التقاء. 50-60٪ من التقاء الخلايا مناسب. أولاً، إضافة المكورات العنقودية Enterotoxin E بتركيز واحد ميكروغرام لكل ملليلتر إلى كل بئر.
تأكد من أن خلايا راجي نبض مع superantigen وإلا فإن مستقبلات الخلية T من خلايا جوركات لن تعترف SCE ولن يتم تشكيل المشبك. احتضان الحجرة في الانزلاق 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، الحصول على ثقافة النمو سابقا من خلايا جوركات بتركيز بين 1 و 2 مليون خلية لكل ملليمتر.
مراقبة الخلايا تحت المجهر النقيض مرحلة ومن ثم نقل الخلايا إلى أنبوب V-أسفل 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا و resuspend بلطف الخلايا في الحارة، والثقافة الكاملة المتوسطة بتركيز 1 مليون خلية لكل ملليلتر.
ثم الحفاظ على خلايا جوركات في الثقافة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون حتى جاهزة للاستخدام. استرداد شرائح الغرفة التي تحتوي على تعقب الخلية الأزرق المسمى المكورات العنقودية Enterotoxin E نبضت الالتزام خلايا راجي من الحاضنة. بعناية التعرق المتوسط الثقافة من كل بئر واحد تلو الآخر مع ماصة وضعت في زاوية من البئر.
استبدال على الفور المتوسطة مع 200 ميكرولترات من خلايا Jurkat resuspended في وسط ثقافة الخلية. إذا كان يجري تنفيذ الفاصل الزمني، انتقل بسرعة إلى المجهر. حدد موقع الشريحة المُتَوَرَض عليها على النادل المُقَمَّر وحدد بعض الحقول المناسبة.
إعداد المجهر وغرفة الحضانة قبل التصوير. بعد أن تم إضافة خلايا جوركات إلى كل بئر تحتوي على خلايا راجي، حدد بسرعة الشريحة غرفة microwelled على المجهر المسخ مسبقا نظمت حاضنة واختيار بعض المواقف XY. إذا كان من المقرر فقط تجربة نقطة النهاية، احتضان الشريحة الغرفة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين.
بعد فترة الثقافة، تحقق من وجود تشكيل مترافق ثم قم بعد ذلك بإصلاح القارن كما هو موضح في بروتوكول النص. لإصلاح الخلايا، أضف دورة في الدقيقة الدافئة بدون FCS واهتزز بلطف. التعرق RMPI وإضافة 200 ميكرولترات من أي PFA أو الأسيتون prechilled إلى كل بئر.
احتضان الشريحة الغرفة في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم غسل كل مرتين مع PVS وإضافة 200 ميكرولترات من محلول التبريد. في هذه الدراسة، يتم إنشاء نقاط الاشتباك العصبي المناعي Jurkat-Raji و المراحل المبكرة من تكوين المشبك المناعي بشكل صحيح.
هذه الاستراتيجية تحفز تشكيل المشبك المناعي في حين تؤدي في وقت واحد التصوير الفاصل الزمني. تظهر هنا ممثل jurkat-Raji conjugates التي تم الحصول عليها من هذه التقنية ، بما في ذلك صورة لقناة الإرسال ، وقناة تعقب الخلية الزرقاء ، واندمجت كل من هذه القنوات. يمكن رؤية بعض conjugates متشابك، بما في ذلك تلك التي تتكون من خلية جوركات واحدة فقط والعديد من خلايا راجي، والتي هي الاقتران المعقدة.
انخفاض تركيزات الخلايا سوف يتحايل على تشكيل مترافقات خلوية معقدة ولكن قد لا توفر ما يكفي من اقترانات الخلية للتحليل اللاحق لحركة المرور المستقطبة، والتي بدورها سوف تقلل من فرص العثور على صور و لتقحم متشابكة الناشئة. يتم تنفيذ إزالة الفولت من صور قناة GFP-CD63 الفلورية مع برنامج فك التشفير المناسب باستخدام الخيار البصري مجال واسع والمعلمات البصرية المناسبة. تم دمج هذه القناة deconvoluted في وقت لاحق إلى قناة واسعة تعقب الخلية الأزرق.
هناك تحسن في كل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء والحدة. يظهر هنا مكدس Z ممثل من اقتران متشابك مناعي ثابت. يتم تنفيذ immunofluorescence باستخدام phalloidin لتصور F-actin، المضادة لـ CD63 لتصور MVB، ومضاد غاما-توبولين لتصور MTOC في حين أن تعقب الخلية الأزرق المسمى خلايا راجي.
سوف تحويل اختياري من خلايا جوركات تسمح التصور لحركة المرور من حبيبات إفرازية في الخلايا الحية. على سبيل المثال، عندما يتم التعبير عن GFP-CD63، يمكن تسجيل حركة الفيزيات ذات الزخارف GFP-CD63. البروتوكول متوافق مع بروتوكولات تثبيت نقطة النهاية التي من شأنها أن تسمح بمزيد من بروتوكولات وتحاليل تلطيخ الفلوروسين.
توجد نماذج تجريبية للإنتاجية قد تبسط التصوير في المشبك المناعي ولكن هذه النماذج لا تحاكي السطح المعقد وغير المنتظم على خلايا مقدم المستضد التي قد تنتج تفاعلات غير فسيولوجية في المشبك المناعي. النهج الموصوف هنا مناسب لإعادة إنتاج وتأكيد بعض التعقيدات البيولوجية التي تحدث في المشبك المناعي. Superantigen هو السم الخطير لذا يرجى التأكد من ارتداء القفازات، وإسقاط الطرف المستخدم على مربع الخطرة.
