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High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

US Food and Drug Administration

To standardize the amount of biological material between samples (e.g., number of cells or amount of tissue) for quantitative real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR), the cycle of the target gene at which expression is detected (the cycle threshold, or Ct) is divided by the Ct of a gene either thought to be unaffected by experimental conditions or similarly expressed among donors. Genes that maintain cellular structure or homeostasis, referred to as housekeeping genes, or 18S ribosomal RNA are often used for this purpose. Although unstable or inconsistent housekeeping gene expression will misrepresent experimental effects on target gene expression, housekeeping genes are often chosen arbitrarily rather than systematically. We designed a simple and systematic approach towards selection of housekeeping genes based on Ct variance (as reflected by the standard deviation) and normality of distribution. We validated this approach by comparing stability and consistency of expression of 11 housekeeping genes across different types of cells, experimental treatments, and human donors. Finally, we demonstrated the consequences of inconsistent housekeeping gene expression on the calculation of target gene expression, and conclude that validation of stability of housekeeping gene expression by considering both distribution normality and standard deviation is straightforward and critical for proper experimental design.

Systematic method for determining an ideal housekeeping gene for real-time PCR analysis.

&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x5168;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5173;&#x8054;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x89D2;&#x8272;&#xFF0C;&#x4E3A; 12 &#x4EBA;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; (&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;-&alpha;) &#x548C; 3 &#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &lambda; &#x4E9A;&#x578B;&#xFF0C;&#x53EF;&#x901A;&#x8FC7;&#x5B9A;&#x4E49;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7EC4;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x6A21;&#x5F0F;&#x6765;&#x9610;&#x660E;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x514B;&#x670D;&#x4E4B;&#x95F4;&#x6BCF;&#x96C6;&#x9AD8;&#x540C;&#x6E90;&#x6027;&#x7684;&#x969C;&#x788D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x91C7;&#x7528;&#x5206;&#x5B50;&#x4FE1;&#x6807;&#x548C;&#x9501;&#x7684;&#x6838;&#x9178; (&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;) &#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5728;&#x67D0;&#x4E9B;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5B9E;&#x65F6; pcr&#x3002;&#x7136;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x91CF;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;&#x5B50;&#x7C7B;&#x578B;&#x8868;&#x8FBE;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x5916;&#x5468;&#x8840;&#x5355;&#x4E2A;&#x6838;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x7EAF;&#x51C0;&#x7684;&#x5355;&#x6838;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3001; &#x6811;&#x7A81;&#x72B6;&#x7EC6;&#x80DE; (mDC)&#x3001; &#x6D46;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6837;&#x6811;&#x7A81;&#x72B6;&#x7EC6;&#x80DE; (pDC) &#x548C;&#x5355;&#x6838;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6E90;&#x6027;&#x5DE8;&#x566C;&#x7EC6;&#x80DE; (MDM) &#x548C;-&#x6811;&#x7A81;&#x72B6;&#x7EC6;&#x80DE; &#xFF08;&#x6811;&#x7A81;) &#x4FDD;&#x5229;&#x56DE;&#x5E94;&#x6211;&#xFF1A; C&#x3001; &#x8102;&#x591A;&#x7CD6; (LPS)&#x3001; &#x54AA;&#x55B9;&#x83AB;&#x7279;&#x548C; CpG &#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;&#x9488;&#x5BF9;&#x4FDD;&#x5229;&#x6211;&#xFF1A; &#x5B50;&#x7C7B;&#x578B;&#x6A21;&#x5F0F;&#x4E3B;&#x8981;&#x9650;&#x4E8E;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &beta; &#x548C;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &lambda;1 C &#x548C;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#xFF0C;&#x5355;&#x6838;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684; MDM &#x548C;&#x6811;&#x7A81;&#x5FEB;&#x9012;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x5F15;&#x8D77;&#x4E86;&#x4E2D;&#x592E;&#x4EBA;&#x6C11;&#x653F;&#x5E9C;&#x8868;&#x8FBE;&#x6240;&#x6709;&#x7684; I &#x578B;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;&#x5B50;&#x7C7B;&#x578B;&#x7531; pDC&#x3001; &#x54AA;&#x55B9;&#x83AB;&#x7279;&#x5374;&#x6CA1;&#x6709;&#x8FD9;&#x6837;&#x505A;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;MDM &#x548C; mDC &#x7684;&#x9AD8;&#x6548;&#x8868;&#x8FBE;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;-&lambda; &#x548C;&#x4E9A;&#x578B;&#x7684;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &lambda; &#x5E72;&#x6270;&#x7D20;-&lambda;2&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x662F;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &lambda;3 &#x6309;&#x5C42;&#x6B21;&#x7ED3;&#x6784;&#x8868;&#x793A;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &lambda;1 &#x9075;&#x5FAA;&#x7684;&#x987A;&#x5E8F;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x652F;&#x6301;&#x534F;&#x8C03;&#x4E00;&#x81F4;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x548C;&#x914D;&#x4F53;&#x7279;&#x5B9A;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x7684;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#xFF0C;&#x6211;&#x548C;&#x4E09;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;&#x3002;&#x5728;&#x5404;&#x79CD;&#x4E0A;&#x4E0B;&#x6587;&#x4E2D;&#x5B9A;&#x4E49;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;&#x5B50;&#x7C7B;&#x578B;&#x8868;&#x8FBE;&#x8C31;&#x53EF;&#x6F84;&#x6E05;&#x4E9A;&#x578B;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x9632;&#x62A4;&#x3001; &#x6CBB;&#x7597;&#x6216;&#x81F4;&#x75C5;&#x7684;&#x8C03;&#x89E3;&#x5458;&#x7684;&#x7279;&#x6B8A;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x4EBA;&#x4F53;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &alpha; &#x5E72;&#x6270;&#x7D20; lambda &#x4E9A;&#x578B;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x8C31;&#x662F;&#x914D;&#x4F53;&#x548C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x3002;

Recent genome-wide association studies suggest distinct roles for 12 human interferon-alpha (IFN-Î±) and 3 IFN-Î» subtypes that may be elucidated by defining the expression patterns of these sets of genes. To overcome the impediment of high homology among each of the sets, we designed a quantitative real-time PCR assay that incorporates the use of molecular beacon and locked nucleic acid (LNA) probes, and in some instances, LNA oligonucleotide inhibitors. We then measured IFN subtype expression by human peripheral blood mononuclear cells and by purified monocytes, myeloid dendritic cells (mDC), plasmacytoid dendritic cells (pDC), and monocyte-derived macrophages (MDM), and -dendritic cells (MDDC) in response to poly I:C, lipopolysaccharide (LPS), imiquimod and CpG oligonucleotides. We found that in response to poly I:C and LPS, monocytes, MDM and MDDC express a subtype pattern restricted primarily to IFN-Î² and IFN-Î»1. In addition, while CpG elicited expression of all type I IFN subtypes by pDC, imiquimod did not. Furthermore, MDM and mDC highly express IFN-Î», and the subtypes of IFN-Î» are expressed hierarchically in the order IFN-Î»1 followed by IFN-Î»2, and then IFN-Î»3. These data support a model of coordinated cell- and ligand-specific expression of types I and III IFN. Defining IFN subtype expression profiles in a variety of contexts may elucidate specific roles for IFN subtypes as protective, therapeutic or pathogenic mediators.

Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.

Des &eacute;tudes r&eacute;centes de genome-wide association sugg&egrave;rent des r&ocirc;les distincts pour 12 humain interf&eacute;ron-alpha (IFN-&alpha;) et IFN-&lambda; 3 sous-types qui peut &ecirc;tre &eacute;lucid&eacute; en d&eacute;finissant les patrons d&#39;expression de ces g&egrave;nes. Pour surmonter l&#39;obstacle de la forte homologie entre chacun des ensembles, nous avons con&ccedil;u une quantitative PCR en temps r&eacute;el qui incorpore l&#39;utilisation des phares mol&eacute;culaires et des sondes d&#39;acide nucl&eacute;ique verrouill&eacute; (LNA) et dans certains cas, les inhibiteurs d&#39;oligonucl&eacute;otide de LNA. Nous avons ensuite mesur&eacute; IFN sous-type expression par les cellules mononucl&eacute;aires de sang p&eacute;riph&eacute;rique humain purifi&eacute;s des monocytes, cellules dendritiques my&eacute;lo&iuml;des (mDC), plasmacytoides (pDC), les cellules dendritiques et macrophages d&eacute;riv&eacute;s de monocytes (MDM) et - les cellules dendritiques (CDMD) en r&eacute;ponse &agrave; poly je: C, lipopolysaccharide (LPS), imiquimod et oligonucl&eacute;otides CpG. Nous avons constat&eacute; qu&#39;en r&eacute;ponse &agrave; poly je: C et LPS, monocytes, MDM et CDMD express un motif de sous-type limit&eacute; principalement &agrave; l&#39;IFN-&beta; et IFN-&lambda;1. En outre, tandis que l&#39;expression de CpG a suscit&eacute; de tout type je sous-types IFN de pDC, imiquimod n&#39;a pas. En outre, MDM et mDC hautement expriment IFN-&lambda; et les sous-types d&#39;IFN-&lambda; sont exprim&eacute;s hi&eacute;rarchiquement dans l&#39;ordre IFN-&lambda;1 suivie par IFN-&lambda;2, puis IFN-&lambda;3. Ces donn&eacute;es prennent en charge un mod&egrave;le d&#39;expression coordonn&eacute;e et ligand-sp&eacute;cifiques des cellules de types I et III IFN. D&eacute;finition des profils d&#39;expression IFN sous-type dans une vari&eacute;t&eacute; de contextes peut &eacute;lucider des r&ocirc;les sp&eacute;cifiques pour les sous-types de IFN comme m&eacute;diateurs protectrices, th&eacute;rapeutiques ou pathog&egrave;nes.

Profils d&#39;expression de l&#39;interf&eacute;ron-alpha humain et sous-types de l&#39;interf&eacute;ron-lambda sont ligand et d&eacute;pendant des lymphocytes.

Neuere genomweiten Verband-Studien legen nahe, unterschiedliche Rollen f&uuml;r 12 menschlichen Interferon-Alpha (IFN-&alpha;) und 3 IFN-&lambda; Subtypen, die durch die Definition der Ausdrucksmuster dieser Gruppen von Genen aufgekl&auml;rt werden kann. Um die Behinderung durch hohe Homologie zwischen den einzelnen Sets zu &uuml;berwinden, haben wir eine quantitative Echtzeit-PCR-Assay, das beinhaltet die Verwendung von molekularen Leuchtfeuer und verschlossene Nukleins&auml;ure (LNA) Sonden, und in einigen F&auml;llen LNA-Oligonukleotid-Hemmer entwickelt. Wir messen dann IFN Untertyp Ausdruck von Menschenblut peripheren mononukle&auml;ren Zellen und gereinigten Monozyten, myeloide dendritische Zellen (mDC), Plasmacytoid von dendritischen Zellen (pDC), und Monozyte abgeleiteten Makrophagen (MDM) und -dendritische Zellen (MDDC) als Reaktion auf Poly ich: C, Lipopolysaccharid (LPS), Imiquimod und CpG-Oligonukleotiden. Wir fanden, dass als Reaktion auf Poly ich: C und LPS, Monozyten, MDM und MDDC Express eine Subtyp-Muster in erster Linie auf IFN-&beta; und IFN-&lambda;1 beschr&auml;nkt. Dar&uuml;ber hinaus w&auml;hrend der CpG entlockt Ausdruck aller Typ I IFN-Subtypen von pDC, Imiquimod nicht. Dar&uuml;ber hinaus MDM und mDC sehr schnelles IFN-&lambda; und die Untertypen von IFN-&lambda; werden in der Reihenfolge, die IFN-&lambda;1 gefolgt von IFN-&lambda;2 und IFN-&lambda;3 hierarchisch ausgedr&uuml;ckt. Diese Daten unterst&uuml;tzen ein Modell f&uuml;r die koordinierte und Ligand-zellspezifische Ausdruck der Typen I und III IFN. Definieren von IFN Untertyp Ausdruck Profilen in einer Vielzahl von Kontexten kann bestimmte Rollen f&uuml;r IFN-Subtypen als Schutz-, therapeutische oder pathogenen Vermittler erhellen.

Ausdruck profile menschlichen Interferon-Alpha und Interferon-Lambda-Untertypen sind Ligand und Zelle-abh&auml;ngige.

Recenti studi di associazione genome-wide suggeriscono ruoli distinti per 12 umana interferone-alfa (IFN-&alpha;) e 3 IFN-&lambda; subtypes che pu&ograve; essere chiarita definendo il pattern di espressione di questi insiemi di geni. Per superare l&#39;impedimento di elevata omologia tra ciascuno dei set, abbiamo progettato un dosaggio quantitativo PCR in tempo reale che incorpora l&#39;utilizzo di sonde di acido nucleico locked (LNA) e molecular beacon ed in alcuni casi, gli inibitori del oligonucleotide LNA. Abbiamo quindi misurato IFN sottotipo espressione di cellule mononucleari di sangue periferico umano purificati monociti, cellule dendritiche mieloidi (mDC), plasmacytoid (pDC), le cellule dendritiche e macrofagi monocyte-derivati (MDM) e - cellule dendritiche (MDDC) in risposta a poly sono: C, lipopolisaccaride (LPS), imiquimod e oligonucleotidi CpG. Abbiamo trovato che in risposta a poly sono: C e LPS, monociti, MDM e MDDC express un pattern di sottotipo limitato principalmente a IFN-&beta; e IFN-&lambda;1. Inoltre, mentre CpG manifesta espressione di tutti i tipo I sottotipi IFN da pDC, imiquimod non ha fatto. Inoltre, MDM e mDC altamente esprimono IFN-&lambda; e i sottotipi di IFN-&lambda; sono espressi in ordine gerarchico nell&#39;ordine di IFN-&lambda;1 seguita da IFN-&lambda;2 e &lambda;3 IFN. Questi dati supportano un modello di espressione di specifiche cellule e ligando coordinato dei tipi I e III IFN. Definizione di profili di espressione del sottotipo IFN in una variet&agrave; di contesti pu&ograve; chiarire ruoli specifici per i sottotipi di IFN come mediatori protettivi, terapeutici o patogeni.

Profili di espressione di interferone-alfa e l&#39;interferone-lambda sottotipi sono ligando e cellula-dipendente.

&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x30EF;&#x30A4;&#x30C9;&#x95A2;&#x9023;&#x7814;&#x7A76;&#x304A;&#x52E7;&#x3081; 12 &#x4EBA;&#x9593;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30ED;&#x30F3;-&alpha; (IFN-&alpha;) &#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x5F79;&#x5272;&#x3068; 3 IFN &lambda; &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306F;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x3092;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x89E3;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5404;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x9AD8;&#x3044;&#x76F8;&#x540C;&#x6027;&#x306E;&#x969C;&#x5BB3;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x306F;&#x3001;LNA &#x306E;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x6291;&#x5236;&#x5264;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30D3;&#x30FC;&#x30B3;&#x30F3;&#x3068;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x9178; (LNA) &#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x304C;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0; PCR &#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x305D;&#x306E;&#x5F8C; IFN &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x767A;&#x73FE;&#x7CBE;&#x88FD;&#x5358;&#x7403;, &#x9AA8;&#x9AC4;&#x7CFB;&#x6A39;&#x72B6;&#x7D30;&#x80DE; (mDC), &#x5F62;&#x8CEA;&#x7D30;&#x80DE;&#x69D8;&#x3067;&#x3072;&#x3068;&#x672B;&#x68A2;&#x8840;&#x5358;&#x6838;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x6A39;&#x72B6;&#x7D30;&#x80DE; (pDC) &#x3068;&#x5358;&#x7403;&#x7531;&#x6765;&#x30DE;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; (MDM) &#x3068; - &#x6A39;&#x72B6;&#x7D30;&#x80DE; (MDDC) &#x30DD;&#x30EA;&#x306B;&#x5FDC;&#x3048;&#x3066;&#x79C1;&#xFF1A; C &#x30EA;&#x30DD;&#x30DD;&#x30EA;&#x30B5;&#x30C3;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C9; (LPS)&#x3001;imiquimod&#x3001;CpG &#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x30DD;&#x30EA; &#x30EC;&#x30B9;&#x30DD;&#x30F3;&#x30B9;&#x305D;&#x306E;&#x3067;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x79C1;&#x306F;: &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7; &#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x5236;&#x9650;&#x3042;&#x308A; IFN &beta; &#x304A;&#x3088;&#x3073; IFN &lambda;1 &#x3092;&#x4E3B;&#x306B; C &#x304A;&#x3088;&#x3073; LP&#x3001;&#x5358;&#x7403;&#x3001;MDM &#x3068; MDDC &#x30A8;&#x30AF;&#x30B9;&#x30D7;&#x30EC;&#x30B9;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x8A98;&#x767A; CpG &#x5F0F;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E; I &#x578B; IFN &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7; pDC &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;imiquimod &#x3092;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;MDM &#x3068; mDC &#x9AD8; IFN &lambda; &#x3092;&#x8868;&#x73FE;&#x3057;&#x3001;IFN-&lambda;2 &#x304A;&#x3088;&#x3073; [IFN &lambda;3 &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;IFN &lambda; &#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x968E;&#x5C64;&#x7684;&#x306B; IFN &lambda;1 &#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x9806;&#x756A;&#x3092;&#x8868;&#x73FE;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3057;&#x3001;III IFN &#x5354;&#x8ABF;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x7279;&#x7570;&#x767A;&#x73FE;&#x578B;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;IFN &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3059;&#x308B; IFN &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x3092;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x4FDD;&#x8B77;&#x3001;&#x6CBB;&#x7642;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x75C5;&#x539F;&#x6027;&#x30E1;&#x30C7;&#x30A3;&#x30A8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x89E3;&#x660E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x4EBA;&#x9593;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30ED;&#x30F3;-&alpha; &#x3068;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30ED;&#x30F3; &#x30E9;&#x30E0;&#x30C0; &#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x3068;&#x30BB;&#x30EB;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xCD5C;&#xADFC; &#xAC8C;&#xB188; &#xB113;&#xC740; &#xD611;&#xD68C; &#xC5F0;&#xAD6C; 12 &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xB860;-&#xC54C;&#xD30C; (IFN-&alpha;)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD558; &#xACE0; 3 IFN-&lambda; subtypes&#xC744; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC9D1;&#xD569;&#xC758; &#xD45C;&#xD604; &#xD328;&#xD134;&#xC744; &#xC815;&#xC758; &#xD558; &#xC5EC; &#xD574;&#xBA85; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC01; &#xC9D1;&#xD569; &#xAC04;&#xC758; &#xB192;&#xC740; homology &#xC7A5;&#xC560;&#xB97C; &#xADF9;&#xBCF5; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBD84;&#xC790; &#xBE44;&#xCF58; &#xBC0F; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC7A0;&#xAE34;&#xB41C; &#xD575; &#xC0B0; (LNA), &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xACBD;&#xC6B0;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;&#xB294; LNA oligonucleotide &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD1B5;&#xD569; &#xC815;&#xB7C9; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; PCR &#xC2DC;&#xD5D8;&#xC744; &#xC124;&#xACC4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB2E4;&#xC74C; IFN &#xD558;&#xC704; &#xC2DD;&#xC744; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xB9D0; &#xCD08; &#xD608;&#xC561; &#xB2E8; &#xC138;&#xD3EC; &#xACE0; &#xC815;&#xD654; monocytes, &#xACE8;&#xC218;&#xC131; &#xC218;&#xC9C0;&#xC0C1; &#xC138;&#xD3EC; (mDC), plasmacytoid&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCE21;&#xC815; &#xB41C; &#xC218;&#xC9C0;&#xC0C1; &#xC138;&#xD3EC; (pDC) &#xBC0F; monocyte &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C; &#xB300; &#xC2DD; &#xC138;&#xD3EC; (MDM) &#xBC0F;-&#xD3F4; &#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xC9C0;&#xC0C1; &#xC138;&#xD3EC; (MDDC) &#xB098;: C, lipopolysaccharide (LPS), imiquimod &#xBC0F; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xC18C;&#xBE44;&#xC7AC; oligonucleotides. &#xC751;&#xB2F5; &#xD3F4; &#xB9AC;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB098;: C&#xC640; LPS, monocytes, MDM &#xBC0F; MDDC &#xC775;&#xC2A4;&#xD504;&#xB808;&#xC2A4; &#xD558;&#xC704; &#xD328;&#xD134; IFN-&beta;&#xC640; IFN-&lambda;1&#xC73C;&#xB85C; &#xC8FC;&#xB85C; &#xC81C;&#xD55C;. &#xB610;&#xD55C;, &#xBAA8;&#xB4E0; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xC18C;&#xBE44;&#xC7AC; elicited &#xC2DD;&#xC740; &#xB3D9;&#xC548; &#xC720;&#xD615; I IFN &#xD558;&#xC704; Pdc&#xC5D0; &#xC758;&#xD574;, imiquimod &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, MDM &#xBC0F; mDC &#xB192;&#xC740; IFN-&lambda;, &#xC775;&#xC2A4;&#xD504;&#xB808;&#xC2A4;&#xC640; IFN-&lambda;&#xC758; &#xD558;&#xC704; IFN-&lambda;2, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; IFN-&lambda;3&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; IFN-&lambda;1 &#xB2E4;&#xC74C; &#xC21C;&#xC11C;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xACC4;&#xCE35;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xD604; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130; I &#xBC0F; III IFN &#xC870;&#xC815;&#xB41C; &#xC140; &#xBC0F; &#xB9AC;&#xAC04;&#xB4DC; &#xD2B9;&#xC815; &#xC2DD; &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; IFN &#xD558;&#xC704; &#xC2DD; &#xD504;&#xB85C;&#xD544; &#xC815;&#xC758; &#xBCF4;&#xD638;, &#xCE58;&#xB8CC; &#xB610;&#xB294; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xC911;&#xC7AC;&#xC790;&#xB85C; IFN &#xD558;&#xC704; &#xC720;&#xD615;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xBA85;&#xB8CC; &#xD558; &#xAC8C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xB860;-&#xC54C;&#xD30C; &#xBC0F; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xB860; &#xB78C;&#xB2E4; &#xD558;&#xC704; &#xC2DD; &#xD504;&#xB85C;&#xD544;&#xC740; &#xB9AC;&#xAC04;&#xB4DC; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC; &#xC885;&#xC18D;.

Estudios de Asociaci&oacute;n de genoma recientes sugieren diferentes roles para 12 humano interfer&oacute;n-alfa (IFN-&alpha;) y &lambda;-IFN 3 subtipos que puede ser aclarado definiendo los patrones de expresi&oacute;n de estos conjuntos de genes. Para superar el impedimento de alta homolog&iacute;a entre cada uno de los conjuntos, hemos dise&ntilde;ado un ensayo PCR cuantitativo en tiempo real que incorpora el uso de marcador molecular y sondas de &aacute;cido nucleico bloqueado (LNA) y en algunos casos, inhibidores de oligonucle&oacute;tidos LNA. Luego medimos IFN subtipo expresi&oacute;n por las c&eacute;lulas mononucleares de sangre perif&eacute;rica por purificada monocitos, c&eacute;lulas dendr&iacute;ticas mieloides (mDC), plasmacytoid (pDC), las c&eacute;lulas dendr&iacute;ticas y macr&oacute;fagos derivados de monocitos (MDM) y - las c&eacute;lulas dendr&iacute;ticas (MDDC) en respuesta a poly me: C, lipopolisac&aacute;rido (LPS), imiquimod y oligonucle&oacute;tidos CpG. Encontramos que en respuesta a poly me: C y LPS, monocitos, MDM y MDDC express un patr&oacute;n de subtipo limitado principalmente a IFN-&beta; y del IFN-&lambda;1. Adem&aacute;s, mientras que la expresi&oacute;n de CpG sacado de todo tipo I subtipos IFN por el pDC, imiquimod no. Adem&aacute;s, MDM y mDC altamente expresan IFN-&lambda;, y los subtipos de IFN-&lambda; expresan jer&aacute;rquico en el orden de IFN-&lambda;1 seguido por IFN-&lambda;2 y luego IFN-&lambda;3. Estos datos apoyan un modelo de expresi&oacute;n espec&iacute;ficos de la c&eacute;lula y ligando coordinada de tipos I y III IFN. Definici&oacute;n de perfiles de expresi&oacute;n de subtipo IFN en una variedad de contextos puede aclarar funciones espec&iacute;ficas para los subtipos IFN como mediadores de protecci&oacute;n, terap&eacute;uticas o pat&oacute;genos.

Maria B. Navarro

Center for Biologics Evaluation and Research

US Food and Drug Administration

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Maria B. Navarro

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Center for Biologics Evaluation and Research

US Food and Drug Administration

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Center for Biologics Evaluation and Research